Name: 循環器死後のラット肺に対する新規ex vivo肺灌流システムの確立 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-18T14:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: 学ぶ ラット循環器死後肺を用いた新規ex vivo肺灌流システムの確立方法。4時間の安定的な肺機能維持と虚血再灌流障害の軽減効果を評価する、シンプルで再現性の高い移植生体学研究モデルです。

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この研究は、中日友好病院の全国高レベル病院臨床研究資金およびエリート医療専門家プロジェクト(助成金番号[2022-NHLHCRF-LX-03-0303]および[ZRJY2021-GG07])によって支援されました。

実験動物は体重250-400gのSD雄ラットでした。ラットは、18〜22°Cの標準的な実験条件下で飼育され、12時間の明暗サイクルが制御され、餌と水に自由にアクセスできました。日中友好病院臨床研究所動物実験委員会が動物実験を承認し、ガイドラインに従って実施しました。すべての手術は全身麻酔下で行われました。図 1 は、EVLP システムの概略図と実際のイメージを示しています。使用されるすべての機器および機器の特定のメーカーとモデルは、材料の表に詳述されています
1. 装置の構成
注:3Dプリントされたプラスチックは、この装置にとって有望な選択肢のようです。しかし、私たちの限られた経験に基づいて、プラスチック材料で結び目を作りながら力を調整することは困難です。力が小さすぎるとチューブが滑り落ちる可能性があり、力が大きすぎるとプラスチックチューブがブロックされる可能性があります。金属製の硬質チューブはこれらの問題を回避し、比較的耐久性があるため、ここではこれらを使用します。
<ol>
	<li>モジュールをプラスチックパイプに接続し、鉄製のフレームスタンドと調整可能なリフティングプラットフォームを使用して、すべての部品を適切な高さに配置します。150 mLの灌流を液体貯蔵タンクに加え、蠕動ポンプを開き、流量を20 mL / minに設定して、灌流がチューブを満たすようにします。</li>
	<li>1.2気管内挿管用の円形の溝を挽きます。低酸素ガスとして、8%O2、6%CO2、および86%N2を含むガス混合物を調製します。人工膜肺を介して低酸素ガスを灌流に流します。血液ガス測定の前に5分間、純酸素で換気してください。</li>
	<li>ラットの解剖学的構造に合うように湾曲した中空の304ステンレス鋼管から肺動脈と心房カニューレを作成します（図2A)。動脈挿管のために円形の溝を挽きます。心房カニューレ壁の遠位端に穴を開け、外壁の環状溝を磨きます(図2C)。チューブの前に排気装置を肺動脈灌流チューブにセットします。</li>
	<li>三方弁をウォーターバスの外部循環システムに接続し、リザーバー、臓器コンパートメント、および肺動脈灌流液の温度を調整します。非ウォーターバス接続パイプの長さを最小限に抑え、デバイスのすべてのポイントで温度誤差を±0.2°Cの範囲で制御します。試験デザインに必要な温度は37°Cです。</li>
	<li>圧力監視ラインに生理食塩水を入れ、圧力監視装置をドナーの肺と同じ高さに調整します。バルブを開いて、圧力監視ラインを肺動脈および静脈灌流ラインに接続し、データコレクターを起動してゼロを設定します。動脈灌流圧と静脈還流圧をリアルタイムで監視します。</li>
</ol>
2. ラットの麻酔
<ol>
	<li>ラットやラット組織を取り扱う前に、個人用保護具(サージカルマスク、手袋、使い捨てのオーバーオール)を着用してください。</li>
	<li>ラットの体重を量り、その体重を記録します。注射器に1000 U / kgのヘパリンを充填し、針で尾静脈に注入します。</li>
	<li>ラットを密閉された誘導チャンバーに入れ、3%イソフルランガスで麻酔します。.ネズミのつま先を固定します。応答がない場合は、ラットが麻酔の望ましい深さに達したことを示しています。それ以外の場合は、麻酔時間を増やし続けます。目の乾燥を防ぐために滅菌眼軟膏を塗布します。.</li>
	<li>複数の縫合糸(3-0または4-0)を準備します。ラットを手術台に移し、仰臥位に置き、縫合糸で固定し、アルコールスプレーで消毒します。</li>
</ol>
3. ドナー肺調達
<ol>
	<li>ラットの頭を麻酔マスクに入れ、1.5%イソフルランを含む空気を送り込んで麻酔を維持します。ネズミのつま先を固定します。応答がない場合は、ラットが麻酔の望ましい深さに達したことを示しています。</li>
	<li>気管の前の首の正中線に沿ってげっ歯類の手術用ハサミで縦2〜3cmの切開を行い、皮膚を切開し、気管の前の筋肉組織を解剖し、気管を完全に露出させます。</li>
	<li>気管の後ろのスペースを解放し、3-0縫合糸を通し、後で使用するために緩い結び目を結びます。気管の結び目の上にげっ歯類の手術用ハサミで0.5cmのV字切開を行い、気管チューブ(14G)を気管に挿入し、縫合糸の結び目を締め、気管チューブを固定します(図3A)。</li>
	<li>気管チューブを人工呼吸器に接続し、電源を入れて、肺の換気を開始します。</li>
	<li>死亡が確認されるまで、麻酔とバイタルサインの変化を確保するために、バイタルサインを頻繁に監視および記録します。</li>
	<li>肺の動員操作を開始し、圧力制御モードで機械換気を再開し、5分間換気します。次のパラメータを使用します:PEEP 3 cmH2O、吸気:呼気(I:E)比1:2、呼吸数40呼吸/分、およびFiO2 0.5。</li>
	<li>気管をクランプし、肺が1時間の温かい虚血時間(WIT)を受けるのを待ちます。WIT期間の後、以下に説明するように肺を摘出し、ランダムに3つのグループに分けます:(1)直接肺採取、(2)4時間の低温静的保存(CS)、および(3)4時間のEVLP評価。</li>
	<li>直接肺を採取するには、得られたドナーの肺を治療せずにさまざまな検査でサンプリングします。4時間の低温静電気保存(CS)の場合、ドナーの肺を4°Cの冷蔵庫で4時間低温保存し、次に検出のためにサンプルを採取します。4時間EVLP評価。4 時間 EVLP 評価の場合は、ステップ 5 に従います。</li>
	<li>手術台を45°の頭高と足の低傾斜位置に調整します。</li>
	<li>ラットの胸部と腹部の中央からヘアシェーバーで毛を取り除き、ヨウ素3倍で消毒し、手術用タオルで覆います。</li>
	<li>げっ歯類の手術用ハサミで腹部の正中線に沿って縦6〜7cmの切開を行い、皮膚を切断し、腹壁を腹腔に開き、腹部の臓器を露出させます。綿棒を使用して腸を腹腔の右側にそっと押し込み、腸の後ろの下大静脈を露出させます。</li>
	<li>注射器を使用して、1000 U / kgのヘパリンの溶液を下大静脈に注入します。.血液の適切なヘパリン化を確保するために5分間待ちます。ヘパリンは、肺動脈の微小血栓形成を防ぎます。</li>
	<li>ラットの下大静脈をハサミで切り、放血します。換気撹拌量 3 mL/kg、呼気終末陽圧 (PEEP) 2 cmH2O、呼吸数 60 回/分、I:E 比 1:2 で、初期人工呼吸器の設定で肺の機械換気を開始します。</li>
	<li>鉗子を使用して剣状突起を持ち上げ、胸骨に沿って下から上に縦方向に切開します。リブスプレッダーを使用して胸腔を露出させます。胸腺組織を切除して、心臓とその下の主要な血管を露出させます. 
	注:ラットの肺は壊れやすいです。金属製の器具でそれらや腹部の臓器に触れないでください。視認性を高めるために、綿棒で肺をそっと脇に押します。</li>
	<li>ラットの大動脈と肺動脈の後ろのスペースを解放し、3-0縫合糸を通し、後で使用するために緩い結び目を作ります。</li>
	<li>右心室流出路の前面に2〜3mmのV字型切開を行い、切開部を通じて肺動脈カニューレを肺動脈に挿入し、事前に結ばれた縫合糸を締めてカニューレを固定します(図3B)。</li>
	<li>ラットの心臓の先端を切断し、止血鉗子を左心室に挿入し、左心室と左心房の間の弁を破壊し、左心房の流出路が明確であることを確認します。</li>
	<li>肺動脈カニューレを灌流回路に接続し、15 mLの低カリウム溶液を使用して0.6〜1 mL / minの速度で残留血液を洗い流します。.肺が白くなるまで、または左心室から出てくる灌流液が白くなるまで洗い流します。</li>
	<li>心臓の後ろに縫合糸を配置し、心室を取り囲み、左心室の切開部から左心室カニューレを挿入し、事前に結ばれた縫合糸を締めてカニューレを固定します(図3C)。</li>
	<li>気管チューブの上の気管を切り取り、気管を持ち上げ、はさみを使用して気管の後ろの結合組織を横隔膜のレベルまで下向きに分離します。</li>
	<li>下大静脈と横隔膜の上の主肺動脈を切除し、心臓と肺を切除します (図 3D)。</li>
	<li>肺を膨らませておくには、吸入の終わりに気管の下3分の1をすぐに固定し、心臓と肺を集めて、保存のために低カリウム溶液に入れます。</li>
	<li>心臓と肺をEVLP回路の指定された位置に置き、左心室カニューレを灌流回路に接続します(図4A)。</li>
</ol>
4. ex vivo肺灌流システムの初期化
<ol>
	<li>EVLP回路を組み立てます:チューブ、酸素供給器、リザーバー、蠕動ポンプ、および臓器室を接続します。</li>
	<li>灌流前に、1000 ユニットのヘパリンナトリウム、50 mg のセフォペラゾン、および 50 mg のメチルプレドニゾロンを含む 120 mL の肺灌流修復溶液を EVLP 回路に充填します。肺動脈灌流の最後にある排気装置を使用するために、チューブ内の気泡を取り除きます。</li>
	<li>ウォーターバスを室温に設定し、温水の循環を開始してEVLP回路全体を加熱します。</li>
	<li>コンピューターのデータ収集プログラムを開き、肺動脈圧センサー、肺重量センサー、ポンプ速度センサー、および温度センサーをEVLP回路とレコーダーに接続します。</li>
	<li>血圧モニタリングチューブに生理食塩水を満たし、供給された肺の高さと一致するようにテーブルの高さを調整し、圧力モニタリングチューブを肺動脈と静脈灌流チューブに接続し、バルブを開き、データコレクターを起動し、システムをゼロにします。</li>
	<li>低酸素ガスバルブを開き、灌流溶液が安定した低酸素状態に達するまで低酸素ガスを膜肺に10分間通し、ガスバルブを閉じ、蠕動ポンプを一時停止して、ex vivo肺灌流のためにドナー肺の到着を待ちます。</li>
	<li>小動物用EVLPプラットフォームの近くに手術台と手術器具を準備し、高圧蒸気滅菌で予備滅菌します。</li>
</ol>
5. 生体外肺灌流
<ol>
	<li>バブルトラップに十分な量の灌流溶液を入れて、気泡が肺に入るのを防ぎます(空気塞栓症を引き起こします)。</li>
	<li>心肺ユニットを臓器室に置き、EVLPデバイスに接続し、人工呼吸器と蠕動ポンプをオンにして、EVLP灌流を開始します(図4B)。</li>
	<li>目標流量の20%で灌流を開始し、1時間以内に目標流量まで流量を徐々に増やし、目標流量を心拍出量の20%(75 mL/分/250 gドナー体重)として計算します。</li>
	<li>熱交換器を40°Cに設定して、肺の温度を37.5°Cに保ちます。20分以内に、灌流溶液の温度は25°Cから37°Cに上昇します。</li>
	<li>灌流開始から20分後に気管内クランプを取り外してください。呼吸数 (RR) が 60 bpm、呼気終末陽圧 (PEEP) が 3 cmH2O、初期潮汐量 (VT) が 4 mL/kg で機械換気を開始し、10 分以内に最大潮汐量 6 mL/kg に達します。</li>
	<li>低酸素ガス(8%CO2、6%O2、および86%N2)の流れを開始して、換気中に肺動脈に同時に入る灌流溶液PCO2を維持します 35〜45mmHg。</li>
	<li>灌流中は、灌流溶液の流量、動静脈圧、気道ピーク圧、および肺機能パラメータを常に監視します。</li>
</ol>

Evaluation of Apoptosis and Lung Injury in DCD Donor Lungs Preserved by EVLP

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著者らは、競合する利益はないと宣言している。

この研究では、小動物 EVLP プラットフォームの費用対効果の高いモジュール設計と、DCD のラット モデルにおけるこのプラットフォームの有効性の検証を紹介します。この発見は、EVLP が死亡したドナーの肺の質を大幅に改善し、それによって肺移植の潜在的なドナーのプールを拡大できることを示しています。移植用のドナー肺の不足は、依然として重大な課題です。この問題に対処するために、一部の国ではDCDプログラムの実施を開始しています28。このアプローチは、生存可能な臓器移植片の数を増やすための貴重な戦略を提供します。特に、複数の研究により、DCD 臓器を使用した肝移植後の長期生存率は、DBD29,30 の臓器を使用した臓器を使用した生存率に匹敵することが示されています。しかし、長期にわたる虚血によって引き起こされる広範な損傷のため、DCD ドナーからの肺の利用は依然として限られています31。DCD ドナーから得られる限られた肺資源の効率的な評価と利用は、移植可能な肺の不足を緩和する計り知れない可能性を秘めています。EVLP は、肺の質を改善し、移植前の保存期間を延長できる有望な技術です。4°Cでの冷蔵保管と比較してEVLPの有効性を検証するために、循環死のラットモデルを採用しました。私たちの灌流技術は、虚血再灌流損傷によって引き起こされる損傷を軽減し、循環死後の肺機能を強化できるという仮説を立てています。私たちの実験結果は、Wangら32およびHasenauerら33によって報告された最近の発見と一致しています。
灌流回路全体で一定の温度を維持することは、最適な EVLP 機能にとって非常に重要です。ただし、既存のEVLPシステムの多くは、信頼性が高く適応性のある温度制御メカニズムを欠いています。単一の熱交換システムでは、多くの場合、特定の場所の温度を変化させる調整が必要になります。この温度の変動は灌流液の組成に影響を与え、酸素化指数の測定を中断し、最終的には実験結果の精度を損なう可能性があります。この困難を克服するために、EVLP システムが作成され、リザーバー、肺動脈灌流ゾーン、および臓器室に配置された 3 つの別々のウォーター バス熱交換器が取り付けられました。さらに、このシステムは最小限の配管を使用して熱損失を最小限に抑え、4〜40°Cの範囲内で正確な温度制御を保証します。この構成により、各回路セグメントの測定温度が設定値から±0.2°C以下で、高精度な温度制御が可能になります。この設計は、EVLP実験の厳しい温度制御要件を効果的に満たしています。 
小動物モデルは、臓器が小さいため、肺水腫や無気肺に特にかかりやすい34。これらの合併症は、長時間の灌流実験の実施を著しく妨げます。この課題に対処し、灌流中の最適な肺保護を確保するために、臨床現場における現在のゴールドスタンダードであるトロントアプローチを採用しました。この方法は、灌流液の流量と換気の両方を、設定された時間枠にわたって徐々に増加させることを含む35。灌流は、目標流量の 10% (心拍出量の 20% = 75 mL/分/250 g ドナー重量) で開始され、1 時間かけて徐々に増加しました。同様に、換気は低速度(4 mL / kg)で開始され、一回換気量は10分間にわたって最大6 mL / kgまで徐々に増加しました。この研究では、灌流液にウシ血清アルブミン (BSA) を添加することの利点も強調されています。BSA の補給はコロイド浸透圧を上昇させ、それによって組織浮腫を軽減します36。小動物のEVLPでは、心房カニューレ挿入に基づいて、閉ループと開ループの2つの主要な灌流構成が存在します。閉ループ システムは心房内の一定の低圧を維持し、生理学的状態を模倣し、正確な血液ガス測定を容易にします。Linacr et al. 灌流中に特定の心房圧を維持することで、肺機能が改善され、浮腫が軽減されることが実証されました34.ただし、心房筋が回路を塞いでいる場合、圧力スパイクが発生する可能性があります。さらに、心房をつなぎ、気泡の存在により、心筋線維の損傷の可能性や圧力測定値の不一致により、実験結果が損なわれる可能性があります7。これらの制限を克服し、効果的な閉ループ灌流を達成するために、特別に設計された心房カニューレが作られました。このカニューレは、心房筋による閉塞を防ぐために、先端に突き出たブレースを備えています。さらに、カニューレ本体に沿った環状の溝により、結紮糸の確実な配置が容易になります。さらに、このシステムにはバブルトラップとプレ灌流技術が組み込まれており、空気塞栓症を排除し、一定の灌流圧を維持します。 
小動物のEVLPプラットフォームは、動物の状態の制御、費用対効果、大きなサンプルサイズの収容、灌流液の消費量の少なさなど、多くの利点があるため、科学研究で好まれています。さらに、単一の小動物系統(たとえば、この研究ではラットだけでなく、モルモットとウサギも24、35、36)を使用すると、食事と実験環境の両方を細心の注意を払って制御できます。このシステムの汎用性により、呼吸パラメータと灌流流量を調整することで、これらすべての種に適応することができます。付属のビデオでは、動物モデルと EVLP 手順について詳しく説明しており、研究者に包括的な理解を提供します。これらのプロトコルに従うことで、研究者は実験の成功を高め、動物の苦しみを最小限に抑え、動物全体の使用を減らすことができます。
この研究により、安定性、灌流の質、調整可能性において市販の選択肢を上回る、手頃な価格でモジュール式で使いやすい小動物用のEVLPシステムが確立されましたが、灌流や換気パラメータを含むEVLPプロトコルを最適化し、最も効果的な肺保護薬を特定するには、さらなる調査が必要です。このユーザーフレンドリーで効率的な技術により、インフラストラクチャを活用して多くのドナー肺での検査を成功させることが可能になりました。現在の研究活動は、ドナーからの肺の修復と保存に焦点を当てています。

肺移植(LTx)は、末期肺疾患の患者に対する唯一の決定的な治療法です。肺移植の成功は、適切な機能を備えた高品質のドナー肺の利用可能性にかかっています。しかし、ドナーの肺の深刻な不足により、肺移植の順番待ちリストが世界的に増加しています1。待機リストに載っている多くの患者は、妥当な期間内に適切なドナー肺を待っている間に、健康状態が悪化したり、死亡したりすることさえあります2。したがって、移植待機リストに載っている患者のニーズを満たすために、潜在的な移植片のプールを拡大することが重要です。心循環死後の提供(DCD)1,3およびex vivo肺灌流(EVLP)4,5は、移植に利用可能な肺の数を増やすための2つの有望な戦略です。現在、脳死後の提供(DBD)6が肺移植の主な供給源です。しかし、現在のグラフト不足により、DCDは勢いを増しています。この変化は、血流、人工呼吸器、感染、吸引の変化がグラフトの品質を損なう可能性があるDBDグラフトの限界によって推進されています。移植片の品質は、移植後の患者の転帰と長期生存に直接影響します。ex vivo 肺灌流 (EVLP) プロセスは、心臓死 (DCD) 後にドナーからの肺移植片を再評価することにより、利用可能な肺移植の数を効果的に増加させ、短期および長期の両方で同様の結果をもたらしました7,8.この研究の目標は、周期的に肺が死んだラットにおける体外肺灌流システムを開発し、DCDドナーを正確に評価することでした。原発性移植片機能障害(PGD)の可能性を減らすために、DCDドナーへの害を最小限に抑えることができます10 分子診断法10を使用し、専門的な標的治療を採用することで。
EVLPは、正常な生理学的温度を維持しながら、体外の肺の自然環境を再現する技術です。これにより、肺の継続的な監視と評価が可能になります11,12、移植の保存時間を延長13、外部灌流、換気、および薬物療法を使用して辺縁肺の質を改善し、移植に適したものにします14。EVLPを使用した肺移植のためのマージナルドナー肺の使用に初めて成功したのは、2007年にSteenらによって報告されました15。それ以来、EVLP技術の使用は徐々に臨床診療に統合されてきました16,17。その後、トロントのチームは、遠心ポンプの理想的な肺保護戦略と組み合わせて、低潮汐量換気と低流量を使用することにより、EVLPアプローチを適応させました。これにより、12 時間の安定した灌流が class<xref">18 行われました。
EVLPには、一次移植失敗のリスクの低減、肺水腫の最小化、脳死関連炎症の軽減、移植のためのレシピエントの免疫システムの準備、肺感染症、誤嚥、肺塞栓症、虚血再灌流障害の予防など、いくつかの利点があります14,19,20.EVLPには大きな利点がありますが、グラフトの品質を向上させるための改良された方法が必要です。
現在、ラットEVLPプラットフォームの灌流と換気の特定の設定に関するコンセンサスはありません。Ohsumiら21は、長期間の低温虚血時間(CIT)を受けたドナーの肺が、ex vivo lung perfusion(EVLP)プロセス中および移植後も肺機能をどのように維持できるかを研究するための新しいモデルを考案しました。国際的には、ラットのex vivo肺灌流(EVLP)モデルを作成するためのいくつかの取り組みが行われています22,23,24,25,26,27。したがって、この分野でのさらなる研究を促進するためには、費用対効果が高く、再現性が高く、厳密に制御された小動物EVLPシステムを開発することが不可欠です。既存の小動物用EVLPシステムは、多くの場合、高価であり、さまざまな研究ニーズに合わせて動作条件を変更する柔軟性が限られています。このホワイトペーパーでは、費用対効果が高く、適応性のあるEVLPシステム設計を提案します。さらに、その実装に必要な技術的および外科的手順の詳細な説明を提供します。私たちは、循環停止状態で死亡したラットを用いたモデルを用いて、EVLPがDCD肺の質を改善し、それによって移植のための生存可能な肺ドナーのプールを増やすことを実証しました。私たちは、心循環器死後の小動物のための容易に利用可能なEVLPプラットフォームを確立するために、他の研究者を支援するために、私たちの成功体験を共有することを目指しています。

<table><tbody><tr><td>3.0mm 医療用無菌チューブ</td><td>志坊ポンプ工業株式会社、河北省、中国</td><td>3.0mm</td><td>血液の循環ではなく、血管</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>シグマ・アルブリッチ トレーディング Co.Ltd、上海、中国</td><td>BSAV-RO</td><td>灌流のコロイド浸透圧を高める</td></tr><tr><td>BP-100/102 血管内血圧トランスデューサ</td>ー <td>iWorx Systems, Inc, ニューハンプシャー州, 米国</td><td>BP-100/102</td><td>ラットの肺血管圧の記録</td></tr><tr><td>セファゾリン</td><td>北京psaitong バイオテクノロジー株式会社、北京、中国</td><td>PHR1291</td><td>抗菌感染</td></tr><tr><td>脱酸素装置</td><td>東莞Kewei Medical Instrument、広東省、中国</td><td>モデル仕様なし</td><td>ラットの肺機能を置き換える 血液中のガス交換</td></tr><tr><td>F500 小動物</td><td>用全身麻酔器北京Yi Zejia Technology Co.、LTD、北京、中国</td><td>F500</td> 麻酔ガス混合物(6%O2、8%CO2、86%N2)の<td>供給のためのガス麻酔を投与</td></tr>します 北京<tr><td></td><td>東洋医学ガス株式会社、北京、中国</td><td>モデル仕様なし</td><td>血中酸塩基バランスを維持し、肺血管生理をシミュレートします</td></tr><tr><td>熱交換器</td><td>Changhong精密機器センター、深セン、中国</td><td>DHC-05-B</td><td>灌流回路ヘ</td></tr><tr><td>パリン</td>の温度制御 <td>北京psaitongバイオテクノロジー株式会社、北京、中国</td><td></td><td>H0200000 抗マイクロ血栓症</td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>RWDライフサイエンス株式会社、深セン、</td><td>中国 R510-22</td><td>麻酔ラット</td></tr><tr><td>アイソレーションチャンバー</td><td>上海レイトン工業株式会社、上海、中国</td>手作り <td>モデル仕様なし</td><td>ラット肺の保管</td></tr><tr><td>i-STAT 1 ポータブル臨床分析装置</td><td>アボット・ポイント・オブ・ケア社、ニュージャージー州、米国</td><td>300G</td><td>灌流中の血液ガスの分析</td></tr><tr><td>iWorx RA-834 レコーダー</td><td>iWorx Systems, Inc, New Hampshire, USA</td><td>RA-834</td><td>肺血管圧力信号出力</td></tr><tr><td>マルチチャンネル蠕動ポンプ LabMate</td><td>Zhifang Pump industry Co., LTD, Hebei, China</td><td>LabMate2</td><td>灌流循環のプロセスにエネルギーを供給し</td>ます</tr><tr><td>PERFADEX Plus</td><td>XVIVO Perfusion, ヨーテボリ, スウェーデン</td><td>NA</td><td>ラットドナーからの肺はプレラベーションを受けた;低カリウム溶液&nbsp;</td></tr><tr><td>肺カニューレ</td><td>ステンレス製</td><td>304 ステンレス製/SUS304</td><td>2.0/2.5 mm</td></tr><tr><td>肺静脈カニューレ</td><td>ステンレス製</td><td>304 ステンレス製/SUS304</td><td>4.0mm</td></tr><tr><td>QAH-INF-1 アッセイキット</td><td>Innopsys, Parcd'Activit&eacute;s Activestre</td><td></td><td></td></tr><tr><td>R415 小動物用人工呼吸器</td><td>RWD Life Science Co.,Ltd, Shenzhen,</td><td>China R415</td><td>ラット肺の換気</td></tr><tr><td></td><td>Reservoir Shanghai Leighton Industrial Co., LTD, Shanghai, China</td><td>容量 1 L</td><td>灌流ストレージ</td></tr><tr><td>SOLU-MEDROL</td><td>Beijing psaitong Biotechnology Co., Ltd, Beijing, China</td><td>M0639</td><td>NA</td></tr><tr><td>温度センサー (TM-100)</td><td>iWorx Systems, Inc, New Hampshire, USA</td><td>TM-100</td><td>肺灌流温度の記録</td></tr></tbody></table>

循環器死後のラット肺に対する新規ex vivo肺灌流システムの確立

Establishment of a Novel Ex Vivo Lung Perfusion System for Rat Lungs After Circulatory Death

移植のためのドナー肺の不足が増す中、心臓死(DCD)後にドナーから調達した臓器の利用に大きな関心が寄せられています。しかし、臨床使用のための厳しい基準を満たす生存可能な肺の数を最大化するという重要な課題が残っています。Ex vivo 肺灌流 (EVLP) は、提供された肺の機能を評価し、潜在的に改善するための有望な技術として浮上しています。この論文では、EVLP研究用に特別に設計された、費用対効果が高く再現性の高い小動物実験プラットフォームの開発について説明します。このプラットフォームは高度なカスタマイズを提供し、研究者はEVLPの分野における特定の研究課題に対処するために実験パラメータを調整することができます。チームは、DCDをシミュレートするためのラットモデルを確立し、2段階の保存アプローチを実装しました。肺を4°Cの灌流液を用いて4時間静的低温保存し、続いて常温EVLPをさらに4時間放置した。研究者らは、肺血管抵抗、肺動態コンプライアンス、灌流液の血液ガス測定、肺組織におけるアポトーシス細胞死など、さまざまな肺機能パラメータを評価しました。この研究は、EVLPが4°Cでの単純な冷蔵保存と比較してDCD肺の機能性能を大幅に改善できることを示しており、EVLPが虚血再灌流障害を軽減し、循環器死後の移植機能を強化し、それによって移植可能な肺のプールを増やす可能性があることを示唆しています。

EVLPがDCDドナー肺をどの程度保存できたかを判断するには、全群における拍動ドナー肺のTUNEL染色で検出されたアポトーシス細胞数、炎症マーカーレベル（QAH-INF-1アッセイキットを用いて灌流液中で検出）、および全般的な物理的外観（ヘマトキシリン・エオジン（H&amp;E）染色）を評価することが必要です。すべてのDCDドナー肺に対して4時間の灌流を行いました。ほとんどの肺でコンプライアンスは安定していましたが、4時間の間に緩やかな低下が観察されました (図 5B)。DCDドナー肺間で、血管抵抗および肺グラフトの酸素化レベルに有意な差は認められませんでした (図 5A,C)。灌流液中のグルコース濃度は時間とともに低下しましたが、個々のラット間で有意な差は見られませんでした (図 5D)。灌流液中の電解質レベルは、群間で同等に維持されました (図 5E-F)。
TUNEL染色は、アポトーシス検出キットを用い、製造元の指示に従ってアポトーシス核を検出するための末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼdUTPニックエンドラベル法により実施した。TUNEL染色は、異なる保存条件下におけるDCDドナー肺の肺胞上皮細胞のアポトーシス（プログラム細胞死）を定量化するために用いられた。アポトーシス細胞数のブラインド解析の結果、ドナー群では他の群と比較して陽性細胞数が有意に多いことが明らかになった。さらに、冷保存群は、EVLP灌流を行ったDCDドナー肺と比較して、陽性細胞数が多いことを示した(図 6)。H&amp;E染色された病理切片のスコアリングには、1) 肺胞腔への炎症細胞浸潤、2) 肺胞中隔の肥厚、3) 肺胞内および肺胞外出血、4) 肺胞内浮腫、5) 硝子膜形成の5つの独立変数が用いられた。変数は0～4でスコアリングし、0 = 陰性、1 = 軽度、2 = 中等度、3 = 高度、4 = 重度とした。スコアリングされた変数の合計により、総肺損傷スコアを算出した。肺損傷スコアは、冷静的保存群およびコントロール群よりもEVLP群で有意に低かった(図 7A)。4時間の冷静的保存群では、肺胞壁の肥厚と肺胞出血が観察された(図 7B)。EVLP群では正常な肺胞構造が維持されていた(図 7C)。
<img alt="心肺バイパス装置、膜型酸素化、模式図、実験方法。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67168/67168fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="図1"> 
図1: 小動物ex vivo肺灌流（EVLP）回路の模式図および写真。 模式図中の文字は写真中の文字と対応しており、各構成要素の機能を説明している。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67168/67168fig01large.jpg" target="_blank">こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。</a>
<img alt="クロマトグラフィーシステムの構成部品。金属コネクタ、フィッティング、およびチューブ部品の図解。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67168/67168fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="図 2"> 
図 2: 特注のカニューレ。(A) 肺動脈カニューレ。(B) 気管カニューレ。(C) 左心房カニューレ。(D) ラットex vivo 肺灌流カニューレセット。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67168/67168fig02large.jpg" target="_blank">こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。</a>
<img alt="心血管解剖と臓器露出の手順を示す齧歯類の手術処置図。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67168/67168fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="図 3"> 
図 3: ラット肺の摘出。 (A) 気管カニューレを適切な位置に挿入し、絹縫合糸で固定する。 (B) 肺動脈にカニューレを挿入し、あらかじめ準備しておいた絹縫合糸で結紮する。 (C) 左心房カニューレを絹縫合糸で固定する。 (D) 心肺ブロックを摘出するため、結合組織を鈍的に剥離する。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67168/67168fig03large.jpg" target="_blank">ここをクリックして、この図の拡大版を表示してください。</a>
<img alt="臓器灌流実験のセットアップ；A：チューブの接続、B：研究用の保存チャンバー内の臓器。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67168/67168fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="図 4"> 
図 4: ラット肺灌流のセットアップ。(A) 心肺ブロックをex vivo肺灌流回路に設置する。(B) EVLP回路に接続され、適切に換気および灌流されている肺。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67168/67168fig04large.jpg" target="_blank">こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。</a>
<img alt="生理学的パラメータの経時的グラフ：PaO2/FiO2、CDyn、PVR、グルコース、ナトリウム、カリウム。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67168/67168fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="図5"> 
図5ラットEVLPプロトコルにおける肺機能。 (A-F) 1時間の温虚血時間（WIT）に曝露した後、EVLPに供したドナー肺の肺機能および血液ガス分析。(A) 肺酸素化指数。(B) 動的肺コンプライアンス（Cdyn）。(C) 肺血管抵抗（PVR）。(D) EVLP開始4時間後の灌流液中のグルコース濃度。(E) EVLP開始4時間後の灌流液中のナトリウム濃度。(F) EVLP開始4時間後の灌流液中のカリウム濃度。エラーバーは標準偏差を示す。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67168/67168fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="DCD、DCD+COLD、DCD+EVLP条件を比較したDAPI染色のTUNELアッセイ図。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67168/67168fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="図 6"> 
図 6: 各症例におけるTUNELアッセイの代表的な画像。 TUNEL陽性細胞：緑色蛍光はアポトーシス細胞を示す。DAPI：青色蛍光は核を示す。Merge：プログラム細胞死（アポトーシス）を起こしている細胞を含むすべての細胞。DCDは肺直接摘出群を指す。DCD+COLDは4時間の低温静置保存群を指す。DCD+EVLPは4時間のex vivo肺灌流（EVLP）群を指す。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67168/67168fig06large.jpg" target="_blank">こちらのリンクから、この図の拡大版を表示できます。</a>
<img alt="肺損傷スコアの棒グラフおよび肺組織の組織学的解析、実験結果の図示。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67168/67168fig07.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="図 7"> 
図 7: 肺損傷スコアおよび組織学的所見。(A) 対照群、SCS群、およびEVLP群における肺損傷スコア (*, p &lt;0.05)。(B) 冷静的保存（SCS）ドナーの代表的なヘマトキシリン・エオジン（H&amp;E）染色切片。黒色の矢印は肺毛細血管上皮の破裂を、青色の矢印は肺胞壁の肥厚を示す。 (C) EVLPドナーの代表的なH&amp;E染色切片。赤色の矢印は炎症細胞の浸潤を示す。(D) 直接採取ドナー（対照群）の代表的なH&amp;E染色切片。黒色の矢印は肺毛細血管上皮の破裂および出血を示す。エラーバーは標準偏差を示し、有意差解析は一元配置分散分析（ANOVA）により行った。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67168/67168fig07large.jpg" target="_blank">こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。</a>

その目的は、EVLP全体で4時間一貫した肺機能を維持できる新しいラットのex vivo肺灌流(EVLP)モデルを開発し、げっ歯類モデルにEVLPを適用するための頑丈な方法を提供する実装仕様を業界に提供することです。

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Ex Vivo常温肝灌流の小さな動物モデル

このプロトコルは、循環死後の心臓寄付の実現可能性を高めるための新しいコンディショニング剤または戦略の評価のためのシンプルで柔軟なアプローチを示す。...

循環死後の心臓寄付の前臨床モデル

ここでは、転帰の改善に役立つラット肺移植モデルの最適化を提示します。体重に基づくカフのサイズガイド、4番目の...

温虚血/再灌流損傷のラット肺移植モデル:転帰を改善するための最適化

学ぶ ラット循環器死後肺を用いた新規ex vivo肺灌流システムの確立方法。4時間の安定的な肺機能維持と虚血再灌流障害の軽減効果を評価する、シンプルで再現性の高い移植生体学研究モデルです。

循環器死後のラット肺に対する新規ex vivo肺灌流システムの確立

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