Name: 定量的不可逆テザリングアッセイを用いた共有結合フラグメントのスクリーニング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-28T12:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: 学ぶ定量的不可逆テザリングアッセイを用いた共有結合フラグメントのスクリーニング法。蛍光測定でタンパク質選択的な電子親和性化合物を同定し、質量分析を不要とする効率的な創薬手法を確立します。

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1. フラグメントライブラリの構築
<ol>
	<li>求電子フラグメントのライブラリを設計し、それらを合成または購入します。求電子性フラグメントライブラリは、通常、反応性が軽度の求電子剤(アクリルアミド、クロロアセトアミド、ビニルスルホンアミドなど)にさまざまな化学スキャフォールドが付加されたもので構成されています。求電子フラグメントライブラリは、商用サプライヤーから広く入手可能であり、その設計と構造に関するより詳細なレビューは、他の場所でレビューされています5,11。</li>
	<li>各化合物を DMSO で 50 mM の濃度に溶解し、次に異なる化合物を 384 ウェルリザーバープレート(フラグメントライブラリープレートと呼ばれる)のカラム 3 から 22 の各ウェルに分注します。<ol>
		<li>カラム1、2、23、および24の各ウェルにDMSOを分注し、ポジティブコントロールとネガティブコントロールを行います。プレートレイアウトは、スクリーニングする化合物の数によって異なります(図2)。ライブラリープレートに追加される容量は、qITスクリーニングごとに各ウェルから約1.8 μLが必要であることを考慮し、実行するスクリーニングの数によって異なります。このフラグメントライブラリープレートをあらかじめ準備し、4°Cで保存してください。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67178/67178fig02.jpg"> 
図2:プレートレイアウト。 qIT assay 384ウェルプレートレイアウトの概要。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67178/67178fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
2. アッセイのセットアップ(図3)
<ol>
	<li>組換えタンパク質溶液(任意のバッファー中の標的タンパク質)、qITアッセイバッファー(150 mM NaCl、25 mM Hepes(pH 8))、qITアッセイクエンチバッファー(150 mM NaCl、25 mM Hepes(pH 7.5))、および化合物ストック溶液(DMSO中の求電子フラグメント(50 mM))を調製します。 注:反応バッファーでは、標的システイン残基とフラグメントとの間の反応を加速するためにpH 8が使用されており、非常に反応性の低いフラグメントでも反応速度を測定できます。CPMのマレイミドとシステインチオールとの間に形成されるチオエーテル結合は、より塩基性のpHで加水分解しやすいため、クエンチバッファーではわずかに低いpH7.5が使用されます(たとえば、以前の研究では、システイン-マレイミド結合体はpH 7.3でpH 812よりもはるかに安定していることがわかっています)。</li>
	<li>DMSOフラグメントストック溶液を保管から取り出し、室温で最低2時間放置して、コンパウンドストックを解凍します。</li>
	<li>アルゴンガスで約30分間バブリングすることにより、Degas qITアッセイバッファーを調製します。</li>
	<li>標的タンパク質溶液を脱気したqITアッセイバッファーに完全交換します。重要なことは、DTTやTCEPなどの還元剤は、チオールの定量を妨げるため、100 nM&lt;濃度まで徹底的に除去する必要があるということです。この手順は、以下で説明するように、一連のバッファ交換を繰り返すことで実行できます。<ol>
		<li>脱気したqITアッセイバッファーを超えるタンパク質溶液をスピンフィルターユニットで希釈し、遠心分離(4000 x g、4°C、15分)を使用して濃縮し、繰り返します。通常、1 mLの組換えタンパク質ストック溶液からDTT(1 mM)を十分に除去するには、15分の1の希釈を4ラウンド行う必要がありますが、このステップは元の組換えタンパク質溶液中の還元剤濃度に応じて調整できます。 注:あるいは、脱気された大量のqITアッセイバッファーに対して標的タンパク質溶液を透析しても、同じ結果を得ることができます。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>ターゲットタンパク質溶液(ステップ2.1で生成)を、脱気したqITアッセイバッファー中でタンパク質濃度15 μMに希釈します。384ウェルプレートに十分なデッドボリュームを充填するには、約9 mLの標的タンパク質溶液が必要です。</li>
	<li>1.5%(v/v)TCEP-アガロースの懸濁液を脱気したqITアッセイバッファーに調製します。スクリーニングプレートごとに約9 mLのTCEPアガロース懸濁液が必要です。</li>
	<li>20 μL の TCEP-アガロース溶液を 2 つの 384 ウェルプレートのすべてのウェルに分注します。</li>
	<li>15 μM グルタチオンストックを脱気 qIT アッセイバッファーに調製します。これは、グルタチオンが還元剤なしで溶液中で急速に酸化するため、めっきの直前に準備する必要があります。</li>
	<li>20 μL の qIT アッセイバッファーを、両方の 384 ウェルプレートのカラム 1 と 2 に分注します。</li>
	<li>20 μL の 15 μM タンパク質またはグルタチオン溶液 (目的のプレートに従って) を 384 ウェルプレートのカラム 3-24 に分注します。これらは、タンパク質反応プレートおよびグルタチオン反応プレートと呼ばれます。RTで1時間減らしておきます。</li>
	<li>58.2 μLの脱気したqITアッセイバッファーを384ウェルプレートの各ウェルに分注し、フラグメントライブラリープレートの各対応するウェルから1.8 μLを移して化合物希釈プレートを作成し、各化合物をqITアッセイバッファーと3% DMSOで1.5 mMの濃度に希釈します。 注:このステップは、384ピペッティングステーションを使用すると、1回の操作ですべてのウェルのコンパウンドストックを移送できるため、より簡単になります。</li>
	<li>タンパク質とグルタチオンをTCEPアガロースと1時間インキュベートした後、化合物希釈プレートの各ウェルから20 μLの化合物溶液をタンパク質とグルタチオンの両方の反応プレートに移し、アッセイを開始します。このステップは、384ピペッティングステーションでも簡単に行うことができます。アッセイのステップを 図3にまとめます。 注:フラグメント濃度は必要に応じて変化させることができ、必要に応じて、タンパク質親和性が高フラグメント濃度のアーティファクトではないことを確認するために、低濃度でのヒットに対してqITアッセイを繰り返すことができます。比較的高いフラグメント濃度は、kproおよびkGSHを上昇させるために使用されます。これにより、軽度の反応性化合物(アッセイ条件下でt1/2(GSH)&gt;24時間を表示できる)の正確な速度が決定可能になります。また、500μMのフラグメント濃度は高いが、フラグメントスクリーニングでは高μMから低mMの濃度が用いられている(例えば13)。</li>
	<li>タイマーを開始します - アッセイが開始されており、以下のセクションに従って定期的な時点でクエンチを行う必要があります。</li>
</ol>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67178/67178fig03v2.jpg"> 
図3:qITアッセイの要約。 qITアッセイ反応ウェルセットアップの主要なステップを示す要約。(BioRenderを使用して作成)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67178/67178fig03largev2.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
3. CPMクエンチ
注:CPMクエンチは、タンパク質およびグルタチオン反応プレートに残っている未反応のチオールの量を定量するために行われます。これらは、反応速度を監視できるように、離散的な時点(たとえば、通常は7、15、30、60、120、240、360、1220、および1440分)で実行する必要があります。
<ol>
	<li>DMSOにCPMストック溶液(500 μM)を調製し、微量遠心チューブ内の111.2 μLアリコートに分注し、-20°Cで保存します。 これらのCPMストックは事前に準備することができ、クエンチタイムポイントごとに1アリコートが必要になります。</li>
	<li>CPMクエンチ溶液(1.4 μM)を調製するには、凍結したCPMストック溶液(500 μM)を解凍し、40 mLのqITアッセイクエンチバッファーに添加します。</li>
	<li>27 μLのCPMクエンチ溶液を2つの384ウェルプレートの各ウェルに分注します。タンパク質とグルタチオンの両方の反応プレートをクエンチするには2つ必要です。これらはCPM-Quenchプレートと呼ばれ、使用前に最大30分準備します。</li>
	<li>タンパク質反応プレートを200 x g で3分間遠心分離し、TCEPアガロースがペレット化されていることを確認します。</li>
	<li>あらかじめ決められた時点で、タンパク質反応プレートの各ウェルから3 μLのサンプルを、あらかじめ充填したCPMクエンチプレートに移します。このステップは、384ピペッティングステーションを使用しても簡素化されます。</li>
	<li>CPM Quench Plateを吸引して3 x 25 μLで分注して混合します。CPMクエンチングを妨げる下部のTCEPアガロースが吸引されないように、ウェルの上部からサンプルを取り外すことが重要です。</li>
	<li>グルタチオン反応プレートで手順3.4〜3.6を繰り返します。</li>
	<li>CPMクエンチプレート(3.4-3.6で調製)を室温で1時間インキュベートします。</li>
	<li>CPMクエンチプレートの蛍光強度を測定します(384 nmでの励起と470 nmでの発光)。</li>
</ol>
4. データ分析とヒット選択
<ol>
	<li>各クエンチについて、アッセイ品質の尺度としてZ'を計算します。Z' &lt; 0.5 の CPM クエンチは無視する必要があります。 Z' = 1 - ((3σ正制御 + 3σ負制御) / (μ正制御 - μ否定制御)) ここで、σ = 蛍光強度標準偏差、μ = 蛍光強度平均</li>
	<li>ネガティブコントロールウェルとポジティブコントロールウェルの平均蛍光値を計算します(それぞれ列1と2、列23と24)。</li>
	<li>各反応を、ポジティブコントロールとネガティブコントロールの平均蛍光値によく正規化します。 % 修飾 = 100 x (化合物井戸蛍光 - ネガティブコントロール蛍光) / (ポジティブコントロール蛍光 - ネガティブコントロール蛍光)</li>
	<li>グルタチオンと反応する各化合物および標的タンパク質と反応する各化合物の時間に対する修飾率を別々にプロットします。</li>
	<li>正規化された % modified 対 time データを、次式を使用して、タンパク質とグルタチオンとの反応の両方について、1 相指数関数的崩壊モデルに当てはめます。 % 修正値 = ae - kt + c ここで、a = % 修正値の範囲、k = 反応速度、t = 時間、c = 無限時間における % 修正値。カーブフィッティングとパラメータ決定は、商用ソフトウェア(Graphpadなど)を使用して実行できます。</li>
	<li>フラグメントがタンパク質(kpro)およびグルタチオン(kGSH)と反応する速度を使用して、各フラグメントのレート増強係数(REF)値を計算します。 REF = kpro / kGSH</li>
	<li>REF 値を使用して、ヒットフラグメントを選択します。これは、REFしきい値(例:REF &gt; 3)、任意のヒット率(例:top 2%)を設定するか、またはREF 3標準偏差が幾何平均より大きいフラグメントを選択することによって実行できます。</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>定量的-不可逆テザリング:求電子リガンドの効率的なスクリーニング

<ol><li>Boike, L., Henning, N. J., Nomura, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+covalent+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Advances in covalent drug discovery.</a> Nat Rev Drug Discov. 21, 881-898 (2022).</li>
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<li>Olp, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalent-fragment+screening+of+BRD4+identifies+a+ligandable+site+orthogonal+to+the+acetyl-lysine+binding+sites%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Covalent-fragment screening of BRD4 identifies a ligandable site orthogonal to the acetyl-lysine binding sites.</a> ACS Chem Biol. 15 (4), 1036-1049 (2020).</li>
<li>Qin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acrylamide+fragment+inhibitors+that+induce+unprecedented+conformational+distorions+in+Entereovirus+71+3C+and+SARS-CoV-2+main+protease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharmaceutica+Sinica+B%22%5BJournal%5D)">Acrylamide fragment inhibitors that induce unprecedented conformational distorions in Entereovirus 71 3C and SARS-CoV-2 main protease.</a> Acta Pharmaceutica Sinica B. 12 (10), 3924-3999 (2022).</li>
<li>Jamshidiha, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+first+structurally+validated+covalent+ligands+of+the+small+GTPase+RAP27A%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification of the first structurally validated covalent ligands of the small GTPase RAP27A.</a> RSC Med Chem. 13 (2), 150-155 (2022).</li>
<li>Flanagan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+and+computational+methods+for+the+characterization+of+covalent+reactive+groups+for+the+prospective+design+of+irreversible+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Chemical and computational methods for the characterization of covalent reactive groups for the prospective design of irreversible inhibitors.</a> J Med Chem. 57, 10072-10079 (2014).</li>
</ol>

システイン反応性標的共有結合子(特定のタンパク質上の選択されたシステイン残基と反応することにより生物学的効果を発揮する分子)は、ここ数十年で化学ツールや治療薬としてますます人気が高まっています1。これらは通常、軽度の反応性求電子剤(アクリルアミド、クロロアセトアミド、ビニルスルホンなど)を、タンパク質標的2に対して高い親和性を持つリガンド部分に付加したものです。理想的には、リガンド-タンパク質相互作用は、最初の非共有結合リガンド結合を含む2段階のメカニズムを介して進行し、その後、標的システインと求電子剤3との間に不可逆的な共有結合が形成されます。
Brutonのチロシンキナーゼ阻害剤であるイブルチニブを含むいくつかの初期の標的共有結合リガンドは、以前に同定された可逆的リガンドに求電子ハンドル4を提供することによって開発されました。しかし、このアプローチは常に成功するとは限らず、他の試みでは、親電子剤の設置には大幅な最適化が必要であることがわかっています5。それどころか、特に求電子フラグメントを用いた求電子ファーストのアプローチが近年人気を集めています。これらは典型的には、求電子試薬のライブラリーをタンパク質とインキュベートし、次いでシステインに対する反応速度が増強された化合物を選択することを含み、これはリガンドと結合ポケットとの間の生産的な非共有結合的相互作用によって誘導されると想定される6。特に、これらの方法は、KRAS(G12C)阻害剤であるソトラシブ1の開発中に成功裏に適用されました。
求電子剤優先のスクリーニングは、従来の非共有結合性リガンドスクリーニングと比較すると、主に弾頭クラス内および弾頭クラス間の反応性に大きなばらつきがあるため、いくつかのユニークな課題を提起します7。ほとんどのシステイン反応性求電子試薬は、標的タンパク質の選択的相互作用に関係なく、時間の経過とともに、溶媒に曝露されたすべてのシステイン残基と反応します。したがって、リガンド占有率は、ほとんどすべての求電子試薬で時間とともに増加し、反応性を制御しないと、ヒット選択は、より迅速にターゲットに関与するより反応性の高いフラグメントに偏ることがよくあります8。
さらに、求電子剤ファーストのスクリーニング法では、質量分析を使用してタンパク質-リガンド付加体形成を検出することが多く、スループットには制限があります9。さまざまな求電子性を持つ化合物のライブラリーの反応速度を適切に特徴付けるためには、長期間(数時間から数日)にわたる定期的な反応サンプリングが必要です10。したがって、10 の時点でサンプリングされた 300 個のフラグメントのスクリーニングでは、3000 個の質量スペクトルを実行する必要があり、これはほとんどのタンパク質質量分析システムのスループットを超えています。したがって、タンパク質-リガンド付加体形成をモニタリングするハイスループットな方法が望まれます。
ここで概説したアプローチである定量不可逆テザリング(qIT)アッセイは、内因性反応性を制御し、単純な蛍光読み出しを利用する求電子剤ファーストのスクリーニング法です7。タンパク質、またはグルタチオン(内因性反応性のコントロールとして使用される非構造化のチオール含有トリペプチド)を求電子フラグメントのライブラリーとインキュベートし、通常のサンプルをCPM(7-ジエチルアミノ-3-(4'-マレイミジルフェニル)-4-メチルクマリン、蛍光性チオール定量剤)の溶液にクエンチします。システインと求電子フラグメントとの間の付加物形成は、CPMとの反応に利用可能なチオールの量を減少させ、クエンチング時に生じる蛍光を減少させます。したがって、CPM蛍光は未反応のチオールの代理として機能し、各求電子フラグメントとのチオール反応の速度論を決定することができます。グルタチオンよりもタンパク質反応性が著しく高い求電子フラグメントをヒットとして選択し、さらなる開発に優先的に選別します(図1)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67178/67178fig01.jpg"> 
図1:qITの概略図。 qITアッセイの概略図。(BioRenderを使用して作成)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67178/67178fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
REF値を用いたヒット選択は、固有の反応性を制御し、タンパク質ターゲットとの生産的な非共有結合的相互作用を形成するフラグメントのみがヒットとして選択されるようにします。また、蛍光の読み出しが簡単なため、qITアッセイは非常にスケーラブルで、質量分析ベースの反応モニタリング方法が不要です。
ここでは、qITアッセイの包括的な手順を概説し、アッセイの性能とヒット選択を示すために結果の例を挙げて説明します。

<table><tbody><tr><td>アルゴンガス</td><td>BOC</td><td>I1149</td><td></td></tr><tr><td>コーニング 384ウェル、ローフランジ、フラットボトムアッセイプレート</td><td>コーニング</td><td>3575</td><td></td></tr><tr><td>CPM</td><td>Invitrogen</td><td>D346</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>固定化TCEP-アガロー</td>ス <td>ピアス</td><td>77712</td><td></td></tr><tr><td>マイクロプレートリーダー</td><td>CLARIOstar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR プレートシール</td><td>BioRad</td><td>MSA5001</td><td></td></tr><tr><td>還元型 L-グルタチオン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4251</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>ナトリウム Sigma-Aldrich</td><td>RES6007H-A7</td><td></td></tr></tbody></table>

定量的不可逆テザリングアッセイを用いた共有結合フラグメントのスクリーニング

Covalent Fragment Screening Using the Quantitative Irreversible Tethering Assay

ここでは、qITアッセイを使用して、名前のない単一システインタンパク質の共有結合フラグメントヒットを同定します。標的タンパク質がMg2+イオンに結合することが知られているため、MgCl2(10 mM)を反応バッファーに添加しました。スクリーニングは3回に分けて行い、各フラグメントが標的タンパク質(kpro)とグルタチオン(kGSH)の両方と反応する速度を決定しました。Z'値は、すべてのクエンチプレートで0.5より大きく、タンパク質クエンチで平均0.75、グルタチオンクエンチで平均0.79であり、優れたアッセイ性能を示しました。次に、各フラグメントに対して REF 値が計算され、REF が 3 &gt;ヒットが選択されました。
代表的な結果(図4)は、qITアッセイを用いたヒット選択の一例を示しています。化合物 1 は、グルタチオンよりも標的タンパク質上のシステイン残基と6.0倍高い速度で反応し、REF &gt; 3の基準を使用してヒットとして選択されました(図4B)。この速度加速は、テンプレート効果の存在を示しており、それによって、非共有結合的相互作用が標的タンパク質上のシステインが正しい向きで 1 に位置し、クロロアセトアミド弾頭と反応します。対照的に、 2 は、 2 と標的システイン残基との間の反応が 2 とグルタチオンとの間の反応に比べて加速されないため、非ヒットフラグメントの一例である。速度加速の欠如は、 2 を標的システイン残基と反応するための正しい方向に配置する生産的な非共有結合的相互作用がないことを示しています。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67178/67178fig04v2.jpg"> 
図4:代表的な結果。 その結果、(A)高い内因性反応性、偽陽性の可能性のあるヒットフラグメント、および(B)ヒットフラグメントについて、qITによるタンパク質およびグルタチオン反応のモニタリングが示されました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67178/67178fig04largev2.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

Compounds that form covalent bonds with specific target proteins offer a variety of advantages&#160;as chemical probes and therapeutic agents. Most ...

covalent-fragment-screening-using-quantitative-irreversible-tethering

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

HCNチャネルとそれらの補助サブユニット間の相互作用は、大うつ病性障害における治療標的として同定されています。ここで、このタンパク質 - タンパク質相互作用の小分子阻害剤を同定するための蛍光偏光ベースの方法が提供されます。...

HCN1とTRIP8bの間のタンパク質 - タンパク質相互作用の小分子阻害剤を同定するための方法

この記事では、テロメアの長さを迅速かつ効率的に直接測定できる改良されたターミナル制限断片解析を使用してテロメアの長さを定量化するための詳細なプロトコルについて説明します。この技術は、テロメアの長さを定量するためのDNAの様々な細胞源に適用することができる。...

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力の単一分子分光法のための蛋白質の共有結合固定

単一分子レベルでのDNAの部位特異的切断を測定するための高度に平行な方法が記載されている。このプロトコルは、制限エンドヌクレアーゼNdeIを用いた手法を示す。この方法は、部位特異的なDNA切断をもたらす任意のプロセスを研究するために容易に改変することができる。...

部位特異的DNA切断のための並列高スループット単一分子運動アッセイ

量子ドット標識DNAと全反射蛍光顕微鏡を用いて、非標識タンパク質を用いた制限エンドヌクレアーゼの反応機構を調べることができます。この単一分子技術により、個々のタンパク質-DNA相互作用の大規模な多重化観察が可能になり、データをプールして、十分に蓄積された滞留時間分布を生成できます。...

制限エンドヌクレアーゼ媒介性DNA切断の1分子滞留時間解析

ヘルムホルツ・ツェントルムベルリンでの結晶学的断片スクリーニングは、専用の複合ライブラリ、結晶処理ツール、高速データ収集機能、および大部分が自動化されたデータ分析を含むワークフローを使用して行われます。提示されたプロトコルは、下流の構造ベースのリガンド設計の有望な出発点を提供するために、このような実験の出力を最大化することを意図しています。...

ヘルムホルツ・ツェントルムベルリンにおける結晶学的フラグメントスクリーニングのワークフローとツール

NMRによるフラグメントベースのスクリーニングは、生体高分子(DNA、RNA、またはタンパク質)に対する低分子バインダーを迅速に同定するための堅牢な方法です。自動化ベースのサンプル調製、NMR実験と取得条件、および分析ワークフローを説明するプロトコルが提示されています。この技術により、 1H と 19F の両方の NMR...

NMRベースのフラグメントスクリーニングは、最小サンプルで最大限の自動化モードで

このホワイトペーパーでは、水晶ベースのフラグメントスクリーニングのための完全なXChemプロセスについて、アクセスの申請から始まり、その後のデータ配布までのすべてのステップについて説明します。...

ダイヤモンド光源のXChem施設における効率的なフラグメントスクリーニングの実現

標的タンパク質の溶融温度の変化をモニタリングする(すなわち、熱シフトアッセイ、TSA)は、数百化合物の断片ライブラリーをスクリーニングするための効率的な方法である。フラグメントスクリーニング用の固有トリプトファン蛍光と光逆散乱をモニタリングするためのロボット工学支援ナノ微分走査蛍光測定(nano-DSF)を実装するTSAプロトコルを発表する。...

フラグメントベースのリード発見におけるスクリーニングのためのナノ差動走査フルオリメトリー

ここでは、適合ベクターのセットを使用して、タグ差のあるタンパク質を細菌で共発現させる方法について説明し、その後、 in...

細菌細胞での共発現と組み合わせたプルダウンアッセイは、困難なタンパク質間相互作用をテストするための時間効率の良いツールとして

ここでは、ユビキチンリガーゼVon Hippel-Lindau E3リガーゼ(VHL)およびセレブロン(CRBN)を含むキメラ(PROTACS)を標的とするタンパク質分解によって誘導される三元複合体形成の生物物理学的特性評価のためのプロトコルについて説明します。 本明細書に例示される生物物理学的方法には、表面プラズモン共鳴(SPR)、生物層干渉法(BLI)、および等温滴定熱量測定(ITC)が含まれる。...

キメラを標的としたタンパク質分解による三元複合体形成評価のための生物物理学的アッセイの開発と応用(PROTACS)

学ぶ定量的不可逆テザリングアッセイを用いた共有結合フラグメントのスクリーニング法。蛍光測定でタンパク質選択的な電子親和性化合物を同定し、質量分析を不要とする効率的な創薬手法を確立します。

定量的不可逆テザリングアッセイを用いた共有結合フラグメントのスクリーニング

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