定量的不可逆テザリングアッセイを用いた共有結合フラグメントのスクリーニング
February 28th, 2025
定量的不可逆テザリング(qIT)アッセイは、標的タンパク質と選択的に結合する共有結合フラグメントを同定する蛍光ベースの方法です。ここでは、qITアッセイを説明するための詳細なプロトコルの概要と、結果の例を示します。
私たちは、化学部門と生命科学部門の間で、さまざまな抗がん剤標的に対する新しい反応性共有結合リガンドを開発しています。これらの分子は、将来、治療薬として、または場合によっては化学プローブとして使用されることが期待されています。そのため、共有結合子をスクリーニングするためのいくつかの技術が存在します。
これらは、化合物を培養細胞とインキュベートするプロテオミクス技術と、分子が標識するタンパク質を決定するために使用される質量分析、および求電子試薬のライブラリを個々のタンパク質とインキュベートするターゲットベースの方法に大きく分けることができます。重要な実験的課題は、共有結合性リガンドの反応性に関連しています。過度に反応性の高い分子は、スクリーニングアッセイ中にヒットとして現れることがよくありますが、細胞内の多くの異なるタンパク質を非選択的に標識するため、不適切です。
したがって、活性化合物は、共有結合創薬のすべてのステップで考慮することが重要です。そこで、インペリアル大学のマングループとアームストロンググループは、定量的不可逆テザリングまたはqITアッセイと呼ばれる、タンパク質標的に対する求電子試薬をスクリーニングする新しい方法を開発しました。私たちのプロトコールは、タンパク質ターゲットに対して求電子試薬をスクリーニングする切望されていた新しい方法を提供し、拡張性があり、質量分析を必要とせず、化合物の固有反応性を制御します。
まず、必要なすべてのストック溶液を調製し、実験の2時間前に室温で放置します。ドガス定量、不可逆テザリング、またはアルゴンガスを含むqITアッセイバッファーを約30分間。バッファー交換を行うには、スピンフィルターユニットで脱気したqITアッセイバッファーを超えるタンパク質溶液を希釈し、摂氏4度で4,000Gで15分間スピンしてタンパク質を濃縮します。
次に、脱気したqITアッセイバッファー中で標的タンパク質溶液を15マイクロモルの濃度に希釈し、9ミリリットルの溶液を調製します。TCEP-agraose溶液、qITバッファー、およびグルタチオンストックを384ウェルプレートの適切なウェルに分注します。フラグメントライブラリープレートの各対応するウェルから1.8マイクロリットルを移し、各化合物をqITアッセイバッファーで1.5ミリモルに希釈する化合物希釈プレートと3%DMSOを作製します。
384ピペッティングステーションを使用して、化合物希釈プレートの各ウェルから20マイクロリットルの化合物溶液を両方の反応プレートに移します。まず、目的のタンパク質とグルタチオンを用いた定量的不可逆テザリングまたはqITアッセイを設定します。500マイクロモルCPMストックをマイクロ遠心チューブ内の111.2マイクロリットルアリコートに分注し、摂氏20度で保管します。
CPMストックを解凍した後、40ミリリットルのqITアッセイクエンチバッファーに加えて、1.4マイクロモル溶液を調製します 27マイクロリットルのCPMクエンチ溶液を2つの新鮮な384ウェルプレートの各ウェルに分注します。タンパク質反応プレートを200 Gで3分間遠心分離し、TCEPアガロースをペレット化します。所定の時点で、384ピペッティングステーションを使用して、タンパク質反応プレートの各ウェルから3マイクロリットルのサンプルをCPMクエンチプレートに移します。
下部でTCEPアガロースを吸引しないように、ウェルの上部からサンプルを取り出します。CPMクエンチプレートを室温で1時間インキュベートし、384ナノメートルの励起と470ナノメートルの発光で蛍光強度を測定します。まず、目的のタンパク質を用いて定量的-不可逆的なテザリングまたはqITアッセイを行い、CPMプレートでサンプルをクエンチします。
各クエンチについて、アッセイ品質の尺度としてZプライムを計算します。次に、カラム 1 と 2 のネガティブコントロールウェルとカラム 23 と 24 のポジティブコントロールウェルの平均蛍光値を計算します。各反応をポジティブコントロールとネガティブコントロールの平均蛍光値によく正規化し、グルタチオンと反応する各化合物と標的タンパク質と反応する各化合物の時間に対する修飾率を別々にプロットします。
GraphPadを使用して、正規化された修正率対時間データを、方程式AEをKT Cの累乗にして、両方の反応の1相指数関数的崩壊モデルに適合させます。フラグメントがタンパク質およびグルタチオンと反応する速度を使用して、各フラグメントのレート増強係数またはREF値を計算します。最後に、ヒットフラグメントを選択するには、REF しきい値、任意のヒット率を設定するか、REF 3 標準偏差が幾何平均より大きいフラグメントを選択します。化合物1は、グルタチオンよりも6倍高い速度で標的タンパク質上のシステイン残基と反応し、REFが3を超えるというヒット基準を満たしました。
化合物2は、グルタチオンと比較して、標的システイン残基との反応速度の加速を示さず、生産性の高い非共有結合的相互作用の欠如を示していたため、ヒットとして選択されませんでした。
概要
定量的不可逆テザリング（qIT）アッセイは、標的タンパク質と選択的に結合する共有断片を特定するために設計された蛍光ベースの方法です。この記事では、qITアッセイの詳細なプロトコルを概説し、その適用例を示す結果を挙げています。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 共有薬物発見
- 蛍光ベースのアッセイ
- タンパク質-リガンド相互作用
背景
- がん治療標的に対する反応性共有リガンドの開発。
- 反応性の高い共有リガンドのスクリーニングにおける課題。
- 既存の方法にはプロテオミクス技術と標的ベースの方法が含まれます。
- 化合物の反応性を制御する拡張可能な方法の必要性。
研究目的
- タンパク質標的に対する求電子体のスクリーニングの新しい方法としてqITアッセイを導入すること。
- 質量分析を必要としないプロトコルを提供すること。
- 薬物発見における共有リガンドの選択性を向上させること。
使用した方法
- qITアッセイバッファーの溶液調製と脱気。
- qITアッセイバッファーでのタンパク質濃度と希釈。
- 化合物の希釈と反応セットアップのための384ウェルプレートの使用。
- 化合物の反応性を評価するための蛍光強度の測定。
主要な結果
- 標的タンパク質との反応速度に基づくヒット断片の特定。
- 選択性を決定するための速度増強因子の（REF）計算。
- qITアッセイの有効性を示す例の結果。
- グルタチオンと標的タンパク質との化合物の反応性の比較。
結論
- qITアッセイは求電子体をスクリーニングするための堅牢な方法を提供します。
- 選択的な共有リガンドの特定を可能にします。
- この方法は共有薬物発見の分野を進歩させることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Covalent fragment screening using the quantitative irreversible tethering (qIT) assay addresses a critical challenge in early drug discovery: distinguishing selective covalent binders from broadly reactive compounds. By normalizing for intrinsic compound reactivity and providing quantitative selectivity metrics, qIT enhances predictive confidence at the hit identification and triage stage. This capability supports risk-adjusted portfolio advancement and reduces downstream attrition due to non-selective reactivity.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables robust interrogation of covalent ligand selectivity for target validation.
- Supports mechanistic de-risking by quantifying target-specific reactivity versus off-target background.
- Facilitates prioritization of fragments with favorable selectivity profiles for further development.
Screening & Assay Development
- Delivers a scalable, fluorescence-based assay platform for high-throughput screening of electrophilic libraries.
- Standardizes quantitative measurement of reaction rates with both target proteins and glutathione controls.
- Enables reproducible identification of selective hits based on rate enhancement factor (REF) thresholds.
Translational & Preclinical Research
- Aligns early hit selection with translational requirements by excluding broadly reactive or promiscuous compounds.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation by generating robust, quantitative selectivity data.
- Reduces risk of late-stage failure due to non-specific covalent modification in complex biological systems.
Pipeline & Workflow Integration
The qIT assay integrates at the hit identification and validation stage, bridging early discovery and lead optimization for covalent ligand programs.
- Discovery Biology: Quantifies selective covalent engagement, supporting hypothesis-driven target validation.
- Screening: Provides high-throughput, reproducible, and quantitative outputs for compound triage.
- Analytics: Generates REF values and normalized kinetic data to compare compound selectivity.
- Translational Research: Informs preclinical candidate selection by excluding non-selective electrophiles.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for diverse protein targets and electrophilic libraries.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in hit selectivity and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardizes and scales covalent screening workflows without mass spectrometry.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital allocation by prioritizing selective hits.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement and reduces late-stage attrition from non-selective reactivity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence-based assay setup and kinetic data analysis.
- Needs access to 384-well plate handling and compatible fluorescence plate readers.
- Demands rigorous cross-team standardization of controls and normalization procedures.
- Adaptable to various protein targets and electrophilic fragment libraries.
- Dependent on robust statistical analysis for hit threshold determination and data quality assessment.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:16
Quantitative-Irreversible Tethering Assay for Electrophilic Ligand Screening
2:48
CPM-Quenching to Quantify the Amount of Unreacted Thiol Remaining in the Protein and Glutathione Reaction Plates of Quantitative-Irreversible Tethering Assay
4:18
Data Analysis and Hit Selection After the Quantitative-Irreversible Tethering Assay for Electrophilic Ligand Screening
