酵母全細胞におけるミトコンドリア呼吸の定量化

ミトコンドリア呼吸は、ほとんどの状況下で細胞エネルギーの主要な生成者であり、細胞の代謝と適応度の重要な指標です。したがって、ミトコンドリアの機能は生体エネルギー細胞の状態を描写します。このプロトコルは、生体エネルギーパラメータとしてG生細胞のミトコンドリア呼吸を定量化する技術について説明しています。

このプロトコルに記載されている技術は、レスベラトロールやコイルシテンなどの一部のポリフェノールの生体エネルギーメカニズムを定義するのに役立ちます。また、PTSPTのペントース代謝を測定するツールとしても機能し、キャブツリーの背後の生体エネルギーの変化と地上作業の影響を説明しました。私たちは、細胞の生体エネルギー学に大きな変化を伴って、細胞がどのようにしてキャブツリーやグランドワーク効果などの表現型を獲得するのかを解読することに関心があります。

ミトコンドリア呼吸は、この代謝現象の背後にある分子メカニズムを解明するために不可欠なツールです。まず、3ミリリットルのYPD培地が入った10ミリリットルのガラス試験管に、250マイクロリットルのグリセロール保存酵母細胞を接種します。試験管を摂氏30度で一晩インキュベートし、毎分200回転で絶えず攪拌します。

次に、滅菌ループを使用して、10ミリリットルのガラス試験管で増殖した酵母細胞でYPDオーガープレートをスリークします。孤立したコロニーが現れるまで、ペトリ皿を摂氏30度でインキュベートします。プレ接種物を調製するには、2%グルコースで3ミリリットルのYPD培地に2つまたは3つの単離された酵母コロニーを接種し、インキュベートします。

次に、500ミリリットルの三角フラスコに100ミリリットルの滅菌合成完全培地を入手します。培地に一晩のプレ接種酵母培養液を、600ナノメートルで0.1の初期光学密度で接種します。100マイクロモルのレスベラトロールなどの化学的チャレンジを追加して、ミトコンドリア呼吸をテストします。

次に、中対数期の細胞を空の、事前に秤量した15ミリリットルの円錐管に注ぎ、細胞を4, 000Gで5分間遠心分離します。上清を捨てた後、ペレットを25ミリリットルの脱イオン水で3回洗浄します。洗浄したペレットを含む円錐形のチューブの重量を量り、空のチューブの重量を差し引いて湿重量を求めます。

次に、洗浄したペレットを2ミリリットルの脱イオン水に再懸濁します。まず、レスベラトロールなどの適切な薬で処理された酵母細胞を入手します。5ミリリットルの10ミリモルMES-TEAバッファーと50ミリグラムの湿った細胞を極性グラフトチャンバーに入れます。

クラークタイプの酸素電極を静かに配置して、気泡が形成されないようにします。YSI 5300Aモニターとデータ収集コンピューターの電源を入れます。チャンネル1の設定ダイヤルを選択して空気を送り、チャンネル1のキャリブレーションダイヤルでチャンネル1を100%に調整します。

データの記録を開始し、クロノメーターを使用して時間の測定を開始します。クロマトグラフィーシリンジを使用して、酸化性基質を最終濃度10ミリモルまで添加し、チャンバーを一定の攪拌で閉じたままにします。次に、クロマトグラフィーシリンジを使用してオリゴマイシンを添加し、酸素濃度計チャンバー内の最終濃度0.01ミリモルを取得し、空気消費量を記録します。

同様に、酸素濃度計チャンバー内の最終濃度0.015ミリモルにCCCPを添加して、最大呼吸能力を決定します。次に、電子伝達鎖阻害剤である歯と油のトリフルロシトン(TTFA)を1ミリモルで追加し、続いて1ミリグラム/ミリリットルでアンチマイシンAを追加します。チャンバーを70%エタノールでそれぞれ3回洗浄し、続いて脱イオン水で洗浄してから、次の炭素源に進みます。

まず、さまざまな炭素源とコントロールを使用して、酵母細胞で酸素消費アッセイを実施します。統計ソフトウェアで新しいプロジェクトファイルを作成し、作成セクションでXYを選択します。次に、Enter キーを押すか、データ テーブル セクションの新しいテーブルにデータをインポートします。

オプションセクションで、XサブセクションとYサブセクションの数字を選択します。[横に並べてサブ列に 3 つのレプリケート値を入力する] をクリックします。X列に時間データを入力し、Y列に空気パーセンテージデータを入力します。

線形回帰分析を実行するには、メニュー・バーの「分析」をクリックし、「分析」の下にある「XY分析」で「単純線形回帰」を選択して、「OK」をクリックします。データ テーブルの結果セクションから傾き値を取得します。計算された勾配値をデータシートにコピーします。

呼吸器阻害剤ミックスミックスから得られた傾き値を、酸化性基質、オリゴマイシン、およびCCCPのものから差し引いて、他の酸素消費源を廃棄します。次に、傾きの値に、その状態での酸素の溶解度を表す 237 マイクロモルの酸素を掛けてバッファーします。値を1分あたりの酸素のマイクロモル数に変換し、プロットあたりの時間に応じて調整します。

結果を50で割り、実験で使用した細胞のミリグラムを表します。最後に、酸素消費量は、細胞のミリグラム/分あたりの酸素のマイクロモルとして表されます。0.5%グルコースで増殖した細胞は、5%グルコースで増殖した細胞と比較して、基礎呼吸、ATP関連呼吸、および最大呼吸能力で有意に高い酸素消費量を示しました。

ケルセチンは、0.5%グルコースで増殖した細胞のミトコンドリア呼吸を有意に減少させ、基礎呼吸、ATP関連呼吸、および最大呼吸に影響を与えました。一方、ケルセチンは、5%グルコースで増殖した細胞のミトコンドリア呼吸に有意に影響しませんでした。