Name: 酵母全細胞におけるミトコンドリア呼吸の定量化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 15 s
Description: 学ぶ酵母全細胞におけるミトコンドリア呼吸の定量化手法。ポリフェノールのバイオエネルギー機構を解明し、細胞代謝とエネルギー産生の指標として活用できます。

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<meta charset="utf8"></head><body>細胞の状況を維持しながら酵母ミトコンドリア呼吸を測定

<ol><li>Jang, D. H., Seeger, S. C., Grady, M. E., Shofer, F. S., Eckmann, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dynamics+and+respiration+within+cells+with+increased+open+pore+cytoskeletal+meshes%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Open%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dynamics and respiration within cells with increased open pore cytoskeletal meshes.</a> Biol Open. 6 (12), 1831-1839 (2017).</li>
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<li>Kuznetsov, A. V., Javadov, S., Margreiter, R., Hagenbuchner, J., Ausserlechner, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mitochondrial+function%2C+structure%2C+and+intracellular+organization+in+situ+in+cardiomyocytes+and+skeletal+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Analysis of mitochondrial function, structure, and intracellular organization in situ in cardiomyocytes and skeletal muscles.</a> Int J Mol Sci. 23 (4), 2252(2022).</li>
<li>Divakaruni, A. S., Jastroch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+for+the+analysis%2C+standardization+and+interpretation+of+oxygen+consumption+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Metab%22%5BJournal%5D)">A practical guide for the analysis, standardization and interpretation of oxygen consumption measurements.</a> Nat Metab. 4 (8), 978-994 (2022).</li>
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<li>Granados-Arvizu, J. A., Canizal-García, M., Madrigal-Pérez, L. A., González-Hernández, J. C., Regalado-González, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+alternative+respiration+system+of+Scheffersomyces+stipitis+and+effect+on+glucose+or+xylose+fermentation%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Yeast+Res%22%5BJournal%5D)">Inhibition of alternative respiration system of Scheffersomyces stipitis and effect on glucose or xylose fermentation.</a> FEMS Yeast Res. 21 (2), foab005(2021).</li>
<li>Carrillo-Garmendia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Snf1p%2FHxk2p%2FMig1p+pathway+regulates+hexose+transporters+transcript+levels%2C+affecting+the+exponential+growth+and+mitochondrial+respiration+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genet+Biol%22%5BJournal%5D)">Snf1p/Hxk2p/Mig1p pathway regulates hexose transporters transcript levels, affecting the exponential growth and mitochondrial respiration of Saccharomyces cerevisiae.</a> Fungal Genet Biol. 161, 103701(2022).</li>
<li>Maslanka, R., Zadrag-Tecza, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproductive+potential+of+yeast+cells+depends+on+overall+action+of+interconnected+changes+in+central+carbon+metabolism%2C+cellular+biosynthetic+capacity%2C+and+proteostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Reproductive potential of yeast cells depends on overall action of interconnected changes in central carbon metabolism, cellular biosynthetic capacity, and proteostasis.</a> Int J Mol Sci. 21 (19), 7313(2020).</li>
<li>Olivares-Marin, I. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+carbon+and+nitrogen+sources+depend+on+RIM15+and+determine+fermentative+or+respiratory+growth+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Interactions between carbon and nitrogen sources depend on RIM15 and determine fermentative or respiratory growth in Saccharomyces cerevisiae.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 102 (10), 4535-4548 (2018).</li>
<li>Malecki, M., Kamrad, S., Ralser, M., Bähler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+respiration+is+required+to+provide+amino+acids+during+fermentative+proliferation+of+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial respiration is required to provide amino acids during fermentative proliferation of fission yeast.</a> EMBO Rep. 21 (11), e50845(2020).</li>
<li>Carrillo-Garmendia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxicity+of+quercetin+is+related+to+mitochondrial+respiration+impairment+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Cytotoxicity of quercetin is related to mitochondrial respiration impairment in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 39 (11-12), 617-628 (2022).</li>
<li>Hagman, A., Sall, T., Piskur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+yeast+short-term+Crabtree+effect+and+its+origin%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Analysis of the yeast short-term Crabtree effect and its origin.</a> FEBS J. 281 (21), 4805-4814 (2014).</li>
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<li>Katzmann, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+an+ATP-binding+cassette+transporter-encoding+gene+%28YOR1%29+is+required+for+oligomycin+resistance+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Expression of an ATP-binding cassette transporter-encoding gene (YOR1) is required for oligomycin resistance in Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol Cell Biol. 15 (12), 6875-6883 (1995).</li>
<li>Madrigal-Perez, L. A., Nava, G. M., Gonzalez-Hernandez, J. C., Ramos-Gomez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resveratrol+increases+glycolytic+flux+in+Saccharomyces+cerevisiae+via+a+SNF1-dependet+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bioenerr+Biomemb%22%5BJournal%5D)">Resveratrol increases glycolytic flux in Saccharomyces cerevisiae via a SNF1-dependet mechanism.</a> J Bioenerr Biomemb. 47 (4), 331-336 (2015).</li>
<li>Gueguen, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resveratrol+directly+binds+to+mitochondrial+complex+I+and+increases+oxidative+stress+in+brain+mitochondria+of+aged+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Resveratrol directly binds to mitochondrial complex I and increases oxidative stress in brain mitochondria of aged mice.</a> PloS One. 10 (12), e0144290(2015).</li>
<li>Lagoa, R., Graziani, I., Lopez-Sanchez, C., Garcia-Martinez, V., Gutierrez-Merino, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+I+and+cytochrome+c+are+molecular+targets+of+flavonoids+that+inhibit+hydrogen+peroxide+production+by+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Complex I and cytochrome c are molecular targets of flavonoids that inhibit hydrogen peroxide production by mitochondria.</a> Biochim Biophys Acta. 1807 (12), 1562-1572 (2011).</li>
<li>de Oliveira, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quercetin+and+the+mitochondria%3A+A+mechanistic+view%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Adv%22%5BJournal%5D)">Quercetin and the mitochondria: A mechanistic view.</a> Biotechnol Adv. 34 (5), 532-549 (2016).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>2-テノイルトリフルオロアセトン(TTFA)</td><td>メルク</td><td>T27006</td><td>阻害剤複合体II</td></tr><tr><td>3-クロロフェニルヒドラゾンカルボニルシアン化物(CCCP)</td><td>メルク</td><td>C2759</td><td>ミトコンドリア呼吸アンカプラー&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>アブソリュートエタノール</td><td>メルク</td><td>107017</td><td>ケルセチン溶解用&nbsp;</td></tr><tr><td>寒天</td><td>メルク</td><td>A1296</td><td>YPD 寒天製剤</td></tr><tr><td>硫酸アンモニウム粒状 (NH4)2SO4</td><td>J.T. Baker</td><td>0792-05</td><td>SC ブロス製剤</td></tr><tr><td>アンチマイシン A (AA)</td><td>メルク</td><td>A8674</td><td>阻害剤複合体</td></tr><tr><td>III aYSI5300A</td><td>----</td><td>----</td><td>モニター&nbsp;</td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>Hermle</td><td>Z 206 A</td><td>細胞用遠心分離</td></tr><tr><td>クラーク型酸素</td><td>----</td><td>----</td><td>電極&nbsp;</td></tr><tr><td>コンピュータ</td><td>----</td><td>----</td><td>データ収集用&nbsp;</td></tr><tr><td>リン酸二カリウム K2HPO4</td><td>J.T. Baker</td><td>3252-05</td><td>SC ブロス製剤</td></tr><tr><td>グルコース</td><td>メルク</td><td>G7021</td><td>YPD ブロス製剤</td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>メルク</td><td>G5516</td><td>基質培地の補充&nbsp;</td></tr><tr><td>乳酸</td><td>メルク</td><td>L1250</td><td>基質培地サプリメント&nbsp;</td></tr><tr><td>Streptomyces diastatochromogenes</td><td>Merck</td><td>O4876</td><td>ミトコンドリアATP合成酵素の阻害</td></tr><tr><td>オービタルシェイカー</td><td>サーモフィッシャー</td><td>SHKE6000</td><td>Inoculum インキュベーションガラス管およびフラスコ&nbsp;</td></tr><tr><td>カゼインからのペプトン、酵素消化</td>物メル<td>ク</td><td>82303</td><td>YPDブロス調製</td></tr><tr><td>ケルセチン&nbsp;</td><td>メルク</td><td>337951</td><td>ミトコンドリア呼吸を減少させるため</td></tr><tr><td>ウラシル&nbsp;</td><td>メルク</td><td>U0750</td><td>SCブロス調製</td></tr><tr><td>酵母エキス</td><td>メルク</td><td>Y1625</td><td>YPDブロス調製</td></tr><tr><td>アミノ酸および硫酸アンモニウムを含まない酵母窒素塩基</td><td>メルク</td><td>Y1251</td><td>SCブロス調製</td></tr><tr><td>酵母合成ドロップアウト培地サプリメント ウラシルなし</td><td>メルク</td><td>Y1501</td><td>SCブロス調製</td></tr></tbody></table>

酵母全細胞におけるミトコンドリア呼吸の定量化

Mitochondrial Respiration Quantification in Yeast Whole Cells

このミトコンドリア呼吸法は、Scheffersomyces stipitis15 や K. marxianus16 など、S. cerevisiae 以外の酵母種にも使用できます。ただし、代表的な目的で、S.cerevisiaeからの結果のみを提示します。S. cerevisiaeが低グルコース濃度(0.8 mM未満)で主要な呼吸器代謝を示すことはよく知られています17,18。したがって、S. cerevisiaeの呼吸器表現型を裏付けるために、ミトコンドリア呼吸の刺激(0.5%グルコース)と制限(5%グルコース)の2つのグルコース濃度で増殖させた18,19。予想通り、基礎呼吸(酸化性基質)、ATP結合呼吸(オリゴマイシン)、および最大呼吸能力(CCCP)で得られた結果は、S. cerevisiaeの特徴的なエネルギー代謝を実証しています(図2)。0.5%グルコースで増殖した細胞では、5%グルコースで増殖した細胞で得られた値と比較して、より高い酸素消費量(基礎呼吸、ATP関連呼吸、および最大呼吸容量)が観察されました(図2)。
さらに、アッセイでは、グルコース、グリセロール、L-乳酸の3つの基質を使用しました。多様な基質を採用する目的は、ミトコンドリア呼吸鎖のさまざまな部分を評価することです。これらの状態では、呼吸鎖を乱す治療が追加されていないため、ミトコンドリア呼吸は有意な基質依存的な変化を示さなかった(図2)。
私たちは、ミトコンドリアの呼吸に悪影響を与える化合物であるこの技術の能力を評価するために、ケルセチンを使用した20。得られたデータは、ケルセチンが0.5%グルコースを添加した培地で増殖した細胞のミトコンドリア呼吸を有意に減少させることを示しました(図3)。一方、5%グルコースを添加した培地で増殖した細胞は、ケルセチンによる有意な悪影響を示さなかった(図4)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67186/67186fig01.jpg"> 
図1:代表的な酸素消費量曲線。 SC培地(0.5%グルコース)で増殖した S.cerevisiae 細胞で得られた酸素消費曲線。色は、基質、アンカプラー、および阻害剤の補給で得られるさまざまな傾きを表しています。緑:基質はグルコースと傾斜に対応する基礎呼吸を利用しました。青:オリゴマイシン、ATP合成酵素阻害剤、ATP関連呼吸の測定に用いられる傾き。黄色:CCCP、アンカプラー、最大呼吸数の評価に使用される傾き。灰色と赤:それぞれ阻害剤複合体IIとIII。ミトコンドリアに依存しない酸素消費量を決定するために使用される傾き。略語:CCCP = 3-クロロフェニルヒドラゾンカルボニルシアン化物;TTFA = 2-テノイルトリフルオロアセトン;AA = アンチマイシン A. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67186/67186fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67186/67186fig02.jpg"> 
図2:0.5%および5%グルコースで増殖したS.cerevisiae細胞における酸素消費アッセイ。 ミトコンドリア呼吸は、0.5%および5%グルコースを添加したSCで増殖した S.cerevisiae 細胞における基礎呼吸、最大呼吸能力、およびATP関連呼吸で測定された酸素消費量を通じて評価されます。電子伝達系に対する特異的な影響を評価するために、グルコース(NADHデヒドロゲナーゼ)、グリセロール(ユビキノンプール)、およびL-乳酸(シトクロムc)の3つの基質を使用しました。(A)グルコース、グリセロール、およびL-乳酸を基質として使用した5%および0.5%グルコースでの基礎呼吸。(B)グルコース、グリセロール、およびL-乳酸を基質として使用した5%および0.5%グルコースでの最大呼吸数。(C)グルコース、グリセロール、L-乳酸を基質とする5%および0.5%グルコースでのATP関連呼吸。結果は、3つの独立した実験からの平均± S.D.として提示され、各実験には2つの技術的な繰り返しがあります。統計分析のための一元配置分散分析とそれに続くテューキー検定(p ≤ 0.05、異なる文字:有意差、同じ文字:有意差なし)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67186/67186fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67186/67186fig03_.jpg"> 
図3:ケルセチンは、増殖した S.cerevisiae 細胞の低グルコース濃度でミトコンドリア呼吸を制限しました。 酸素消費量の測定は、SC培地(0.5%グルコース)ケルセチン(100μM)で増殖した S.cerevisiae 細胞における基礎呼吸、最大呼吸容量、およびATP関連呼吸で行いました。エタノールを使用してケルセチン溶液を溶解しました。結果は、3つの独立した実験からの平均± S.D.として提示され、各実験には2つの技術的な繰り返しがあります。統計解析は、スチューデントのt検定ペア(*, ** p ≤ 0.05)を用いて行った。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67186/67186fig03_large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67186/67186fig04_.jpg"> 
図4:ケルセチンは 、出芽酵母の高グルコース濃度ではミトコンドリア呼吸に影響を与えません。 酸素消費量は、SC培地(5%グルコース)ケルセチン(100μM)で増殖した S.cerevisiae 細胞における基礎呼吸、最大呼吸容量、およびATP関連呼吸で測定されました。エタノールは、ケルセチン溶液を溶解するために使用されます。結果は、3つの独立した実験からの平均± S.D.を示しており、それぞれに2回の技術的な繰り返しがあります。統計解析は、スチューデントの対応のあるt検定(p ≤ 0.05;ns:有意でない)を用いて行った。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67186/67186fig04_large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

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経皮針生検によって得られた骨格筋組織から単離されたミトコンドリアの調製と呼吸計測評価

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呼吸法アッセイのためのマウス骨格筋からのミトコンドリアの単離

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