Name: メタン-酸素カウンターグラジエントにおけるメタン栄養生物の培養のためのアガロースベースモデル生態系 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-06T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 31 s
Description: 学ぶメタン酸化細菌の培養法。アガロースベースのモデル生態系を用いてメタン-酸素カウンターグラジエントを再現し、Methylomonas LW13の生理学的特性を空間的に解析する簡便で低コストな手法を解説します。

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本試験で使用した試薬および機器の詳細は、 資料表に記載されています。
1. グラジエントシリンジの調製と押出し
注:グラジエントシリンジの準備は、滅菌技術を使用して行う必要があります。
<ol><li>プレート上で新たに培養した Methylomonas sp. LW13のコロニーを数コロニー使用し、18 mm x 150 mmのガラス管に6 mLの硝酸塩ミネラル塩(NMS)培地を接種します。チューブをセラムストッパーとアルミクリンプシールでシールし、シリンジを使用してメタンを空気中の50%(v / v)メタンの最終雰囲気に添加します。この浮遊性液体培養物を室温で200rpmで濁るまで振とうします(約1日)。</li>
	<li>液体培養物を1:10で新鮮な培地に通過させます。メタン栄養生物の液体培養物を対数期成長(OD600 ~0.5)まで成長させ続け、OD600 = 1.0に調整します。</li>
	<li>付属のプランジャーを取り外し、滅菌容器に保管してシリンジを準備します。滅菌PTFEフィルターチップをシリンジに取り付け、先端を下に向けて標準の試験管ラックに置きます。</li>
	<li>10 mLシリンジ1個につき、ステップ1.2の細胞1 mLを、5 mLのNMSおよび4 mLの溶融アガロース(0.5% m/v、55°Cに冷却)と滅菌コニカルチューブで十分に混合します。これらの容量は、複数のシリンジを並行して充填するためにスケールアップできます。</li>
	<li>ゆっくりと注ぐか、血清学的ピペットを使用して、8 mLのマーキングまで各シリンジに混合物を追加します。.シリンジ内のアガロースを固化させ(~15分)、滅菌済みの20 mmゴムブチルストッパーでキャップします。ラボテープを使用してストッパーをシリンジに固定し、シリンジの内容物でラベルを付けます。</li>
	<li>シリンジのヘッドスペースにメタンを追加するには、大型(60 mL)シリンジに100% CH4 を充填し、滅菌針(23 G)に接続されたPTFEフィルターチップ(0.2 μm、25 mm)を取り付けます。大きなシリンジでゴム栓を突き刺し、ストッパーに2本目の滅菌針を刺してガス出口を作ります。</li>
	<li>大型シリンジのプランジャーを押し下げて、20mLの100%CH4 がヘッドスペースを洗い流し、大型シリンジに1〜2mLのCH4 が残っている場合は、出口針を取り外すように注意して、出口針を通る酸素の逆流を防ぎます。</li>
	<li>シリンジを18°Cでインキュベートし、ステップ1.6と1.7を毎日繰り返してメタンを補充します。</li>
	<li>アガロースを押し出すには、PTFEフィルターチップを滅菌済みの23G針に交換し、ゴム栓を付属のシリンジプランジャーに交換します。プランジャーをゆっくりと押し下げて、1 mL刻みを別々の滅菌1.5 mLマイクロ遠心チューブに分注します。</li>
</ol>2. カウンターグラジエントガス濃度の決定
<ol><li>溶存酸素勾配の測定<ol><li>かみそりの刃を使用して、PTFEフィルターの近くでアガロースを充填したシリンジ(手順1.1〜1.8に従って調製)の幅をスライスします。開いたシリンジをクラーク型微小電極に向けられたシリンジポンプに固定し、開いた端を電極の先端に向けて固定します。</li>
		<li>シリンジポンプの設定を調整して、シリンジを1 mL / min(0.6 cm / min)の速度で微小電極に向かって動かします。シリンジポンプが動き始めたらすぐに、Unisenseロガーソフトウェアで溶存酸素測定値の記録を開始します。</li>
	</ol></li>
	<li>メタン勾配の測定<ol><li>押出しの直前に、シリンジフィルターチップを23G針に接続された一方向ストップコックと交換し、ゴム栓をシリンジプランジャーにすばやく交換します。8 mL の 1 mL アガロースアリコートを分離した 12 mL 気密バイアルに添加し、サンプルを室温で 1 時間平衡化します。</li>
		<li>サンプルバイアルを大気圧に平衡化するには、バイアルを割ってすぐに再密封するか、針に穴を開けてすばやく取り外します。気密シリンジを使用して、水素炎イオン化検出(GC-FID)を備えたガスクロマトグラフに500μLのバイアルヘッドスペースを注入します。CH4 標準試料から導出された検量線を作成し、ピーク面積(pA*min)を μmol/L に変換します。</li>
	</ol></li>
</ol>3. グラジエントシリンジでの細胞のカウント
<ol><li>フローサイトメトリー<ol><li>ステップ1.9で概説したように、野生型または変異型LW13を接種したグラジエントシリンジから1 mLのアガロースセグメントを押し出します。また、ネガティブコントロールとして、無細胞の滅菌シリンジからアガロースを調製し、押し出します。</li>
		<li>0.75 mLの0.85%(m/v)NaClを水に溶かし、すべての押出アガロースサンプルに添加し、ボルテックスにより均質化します。さらに、100 μLを新しい微量遠心チューブに移し、900 μLの塩溶液を加えて、サンプルを1:10に希釈します。</li>
		<li>SYTO9とヨウ化プロピジウムの1:1混合物を3 μL加え、暗所で室温で15分間インキュベートします。アガロースのmLあたりの細胞数を決定するには、マイクロスフェア計数ビーズ懸濁液を水浴中で5分間超音波処理します。次に、フローサイトメトリー分析の前に、各サンプルに10 μLの懸濁液を添加します。</li>
		<li>フローサイトメーター10,11を用いて、緑色蛍光でのトリガー、10 μL/sの流速、1,000 particles/s未満の粒子分析速度でサンプルを解析します。<ol><li>SSC との比較FITCは、無細胞コントロールサンプルと接種アガロースサンプルとの間にドットプロットを行い、バックグラウンドのアガロース粒子を除外する「細菌イベント」電圧ゲートを描画します。さらに、マイクロスフィアカウンティングビーズの電圧ゲートを描画し、サンプル間で一貫性を保つ必要があります。</li>
		</ol></li>
		<li>グラジエントシリンジ内の各アガロースセグメント中の細胞の濃度を決定するには、上記のプロトコルの希釈係数が17.7275であり、10〜6mL が1つのマイクロスフェアビーズの容量であることに注意して、次の式を使用します。 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67191/67191eq01.jpg" style="margin: auto;"></li>
	</ol></li>
	<li>グラジエントシリンジ内のコロニー形成ユニットのカウント<ol><li>1 mLのアガロースセグメントを別々の滅菌済み2 mL微量遠心チューブに押し出し、800 μLのNMSを加え、ピペッティングを支援するために10秒間ボルテックスします。</li>
		<li>各ウェルに180 μLのNMSを添加して、滅菌済みの96ウェルプレートを調製します。希釈したアガロースサンプル20 μLをファーストカラムの各ウェルに加え、ピペットで混合します。</li>
		<li>マルチチャンネルピペットを使用して、1列目のウェルから20μLを2列目のウェルに移し、10回ピペッティングして混合することにより、サンプルを10倍に段階希釈します。このプロセスをプレートの最後の行まで続けます。</li>
		<li>NMS寒天培地または選択した培地を含む正方形のグリッドプレートにラベルを付けます。マルチチャンネルピペットを使用して、96ウェルプレートのカラムから5 μLを寒天プレートにスポットします。寒天プレートのサイズによっては、同じプレート上に複数のカラムを見つけることができます。</li>
		<li>プレートを40%メタン未満で空気中でインキュベートし、18°Cで増殖します。 2〜3日後に細菌のコロニーをカウントし、ミリリットルあたりのコロニー形成単位(CFU / mL)を決定します。</li>
	</ol></li>
</ol>4. 生体分子検出アッセイ
<ol><li>多糖類アッセイ<ol><li>1 mLのアガロースセグメントを別々の2 mL微量遠心チューブに押し出し、1 mLの1%(m/v)Na2CO3 溶液と水で混合します。サンプルを80°Cで30分間加熱し、5〜10分ごとにボルテックスした後、4,000 x g 、4°Cで20分間遠心分離します。</li>
		<li>上清を3容量の100%エタノールと組み合わせて収集し、20°Cで少なくとも2時間(または一晩)インキュベートします。</li>
		<li>エタノール沈殿した多糖類を、16,100 x g 、4°C、30分間遠心分離して回収します。上清を取り除き、ペレットを風乾します。ペレットを100 μLの脱イオン水に再懸濁します。</li>
		<li>フェノール-硫酸比色アッセイ12,13を使用して、各アガロースセグメントの相対的な多糖類含有量を測定します。再懸濁した抽出物50 μLを、150 μLの濃硫酸および30 μLの5%(v/v)フェノール水溶液と、透明な96ウェルプレートに混ぜ合わせます。</li>
		<li>マイクロプレートリーダーを使用して490 nmでの吸光度を測定し、各アガロースセグメントの相対的な多糖類含有量を、PTFEフィルターに最も近いアガロースセグメントの吸光度の割合として計算します。</li>
	</ol></li>
	<li>タンパク質アッセイ<ol><li>アガロースを別々の1.5 mL微量遠心チューブに押し出し、各アリコート100 μLをガラス試験管に移します。</li>
		<li>BCAタンパク質アッセイキットの試験管プロトコルを使用して、総タンパク質濃度を測定します。滅菌シリンジから押し出したアガロースを希釈剤としてアルブミンBSA標準液を調製します。</li>
	</ol></li>
	<li>細胞外DNAアッセイ<ol><li>アガロースを別々の1.5 mL微量遠心チューブに押し出し、各20 μLを0.2 mL微量遠心チューブに移します。</li>
		<li>市販の1x dsDNA高感度アッセイキットを使用して、メーカーのプロトコルに従ってDNA濃度を測定します。</li>
	</ol></li>
</ol>5. RNA抽出
<ol><li>800 mLのRNaseフリー水に、CTAB2.0 g、ポリビニルピロリドン2.0 g(PVP 40)、NaCl 81.8 g、Tris-HCl(pH 8.0)100 mM、EDTA20 mMを混ぜ合わせて、抽出バッファーを調製します。容量を1 Lに上げ、オートクレーブします。4°Cで保存します。</li>
	<li>調製した抽出バッファーを分注し、使用直前に最終濃度のβ-メルカプトエタノールを1%(v / v)加えます。ウォーターバスまたはヒートブロックを使用してバッファーを65°Cに温めます。</li>
	<li>ステップ1.9の手順に従って、アガロースを別々のRNaseフリー2 mL微量遠心チューブに押し出すことにより、各グラジエントシリンジを1 mLセクションに分割します。</li>
	<li>サンプルを21,000 x g、4°Cで15分間遠心分離し、上清を捨ててサンプルを氷上に保持します。</li>
	<li>600 μLの予め加温した抽出バッファーを、ペレット状にした押出アガロース1 mLごとに加えます。約200 μLのジルコニア/シリカビーズを加え、ビーズビーターを使用して30 Hz/sで3分間サンプルを均質化し、途中で一時停止してサンプルを氷上に2分間置きます。</li>
	<li>サンプルを15,000 x g、4°Cで2分間遠心分離し、泡立ちを抑えます。600 μLのクロロホルム:イソアミルアルコール(24:1)をチューブに加え、10秒間ボルテックスしてサンプルを抽出します。</li>
	<li>サンプルを15,000 x g、4°Cで8分間遠心分離します。上水相を新しいRNaseフリー微量遠心チューブに慎重に移し、600μLのクロロホルム:イソアミルアルコール(24:1)を移した上相とボルテックスに10秒間加えます。</li>
	<li>サンプルを15,000 x g、4°Cで8分間遠心分離し、新しい上部水相を新しいRNaseフリーの微量遠心チューブに移します。転写した上相に等量のイソプロパノールを添加し、サンプルを-20°Cで数時間インキュベートします。 オプション:サンプルは-20°Cで一晩放置できます。</li>
	<li>サンプルを16,100 x g、4°Cで30分間遠心分離することにより、RNA含有沈殿物を収集します。</li>
	<li>上清を捨て、ペレットをRNaseフリー水で作った300μLの冷たい75%(v / v)エタノールで洗浄し、16,100 x g、4°Cで5分間遠心分離します。</li>
	<li>手順5.10に従ってペレットを再度洗浄します。</li>
	<li>エタノール上清を取り除いた後、ペレットを15分間自然乾燥させます。ペレットを100 μLのRNaseフリー水に溶解します。</li>
	<li>サンプルをDNase Iで37°Cで30分間、メーカーのプロトコルに従って処理します。</li>
	<li>300 μLの酸性フェノール:クロロホルム:IAA(125:24:1、pH 4.5)を添加してDNase Iを不活性化します。ボルテックスを10秒間ボルテックスし、室温で5分間インキュベートします。</li>
	<li>16,100 x g、4°Cで5分間遠心分離し、新しいRNaseフリーの微量遠心チューブに移して上部水相を保持します。</li>
	<li>オプション:上層を円錐形のチューブに組み合わせることにより、すべての複製シリンジで同じセグメントからのRNAをプールします。</li>
	<li>RNA含有上相の容量に等しい1容量のイソプロパノールを添加し、最終濃度0.8 Mまで7.5 MのLiClを添加し、数回反転させて混合します。</li>
	<li>サンプルを-20°Cで数時間インキュベートします。 オプション:サンプルは-20°Cで一晩放置できます。</li>
	<li>サンプルを16,100 x g、4°Cで15分間遠心分離し、上清を慎重に廃棄します。RNaseフリー水に冷たい70%(v / v)エタノールを加え、16,100 x g、4°Cで5分間遠心分離し、上清を除去して、RNA含有ペレットを2回洗浄します。</li>
	<li>ペレットを室温で10分間風乾させ、50 μLのRNaseフリー水に再懸濁します。RNAサンプルは-80°Cで保存します。</li>
	<li>RNAの品質に応じてオプション:RNA精製キットを使用してサンプルを再精製し、低分子(&lt;200 nt)のRNAを除去できます。</li>
	<li>RNAサンプルに残留DNAが含まれていないことを確認するには、ユニバーサルバクテリア16S rRNA遺伝子プライマー27F/1492Rを使用してPCR増幅するためのテンプレートとして精製されたRNA1μLを使用します。1 μLのゲノムDNA(1:100に希釈)またはヌクレアーゼフリー水を含む2つのPCR反応を追加で含め、それぞれポジティブコントロールとネガティブコントロールとして使用します。</li>
	<li>ゲル電気泳動14を用いて、1%アガロースTBEゲル上で製品を実行します。 注:DNAコンタミネーションのないRNAサンプルでは、サンプルレーンにバンドが存在しないはずです。RNAサンプルにDNAコンタミネーションが見られる場合は、ステップ5.13からサンプルを再処理します。RNAはダウンストリーム分析の準備ができており、オプションでRNAインテグリティナンバー(RIN)を測定することにより、その完全性を定量化するために分析することができます。</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>メタン栄養生物ニッチのモデリング – グラジエントシリンジモデルエコシステム

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</ol>

<table><tbody><tr><td>1% ガス混合分析標準</td><td>Supelco</td><td>22561</td><td>窒素中の各成分 1% 一酸化炭素、二酸化炭素、水素、メタン、酸素</td></tr><tr><td>100% メタン</td><td>エアガス</td><td>ME CP300</td><td>化学的に純粋なグレード</td></tr><tr><td>15 ppm ガス混合分析標準</td><td>Supelco</td><td>23470-U</td><td>窒素中の各成分 15 ppm 窒素中:メタン、エタン、エチレン、アセチレン、プロパン、プロピレン、プロピン、n-ブタン</td></tr><tr><td>1x硝酸塩ミネラル塩&nbsp;</td><td></td><td>以下のCAS番号を参照してください</td><td>以下をMili-Q水とオートクレーブに溶解します:&nbsp; 0.2 g/L MgSO4&middot;7H2O, 0.2 g/L CaCl2&middot;6H2O、1 g/L KNO3、および 30 &mu;M LaCl<サブ>3</サブ>。使用前に、微量元素を最終濃度の1倍に、リン酸緩衝液(pH 6.8)を最終濃度5.8 mMに添加してください。</td></tr><tr><td>23 G ニードル</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>305194 滅菌済み、Luer-Lok</td></tr><tr><td>500x 微量元素</td><td></td><td>以下の CAS 番号を参照</td><td>以下を Milli-Q 水に溶解します: 1.0 g/L Na2-EDTA、2.0 g/L FeSO4&middot;7H2O、0.8 g/L ZnSO4&middot;7H2O, 0.03 g/L MnCl2&middot;4H2O、0.03 g/L H3BO3、0.2 g/L CoCl2&middot;6H2O、0.6 g/L CuCl2&middot;2H2O、0.02 g/L NiCl2&middot;6H2O、および0.05 g/L Na2MoO&middot;2H2O.</td></tr><tr><td>96ウェルプレート</td><td>CELLTREAT</td><td>229596</td><td>滅菌</td></tr><tr><td>酸性フェノール:クロロホルム:IAA (125:24:1)</td><td>Invitrogen</td><td>AM9720</td><td>&nbsp;pH 4.5</td></tr><tr><td>アガロー</td>ス <td>フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>BP160</td><td>分子生物学グレード、CAS 9012-36-6</td></tr><tr><td>アルミニウム クリンプ シール</td><td>VWR</td><td>30618-460</td><td>20 mm</td></tr><tr><td>ビーズビーター</td><td>Qiagen</td><td>9003240</td><td>TissueLyser III</td></tr><tr><td>ブチル ゴム ストッパー</td><td>ケムグラス ライフサイエンス</td><td>50-143-854</td><td>20 mm、青色</td></tr><tr><td>クロロホルム:イソアミル アルコール (24:1)</td><td>ミリポア シグマ</td><td>25666</td><td>BioUltra, for molecular biology</td></tr><tr><td>Clark-type O2</td><td>microelectrode Unisense</td><td>OX-500</td><td></td></tr><tr><td>DEPC 処理水</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0601</td><td></td></tr><tr><td>DNase I (Ambion)</td><td>Invitrogen</td><td>AM2222</td><td></td></tr><tr><td>Flow cytometer</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>CytoFLEX</td></tr><tr><td>ガスクロマトグラフ (水素炎イオン化)検出)</td><td>Agilent</td><td></td><td>6890N</td></tr><tr><td>ガスタイト分析シリンジ</td><td>ハミルトン</td><td>81220</td><td>1750 TLL</td></tr><tr><td>ガスタイト分析シリンジ針</td><td>ハミルトン</td><td>7729-07</td><td>22 G、金属ハブ針、2 インチ、ポイントスタイル 5</td></tr><tr><td>ガスタイトバイアル</td><td>Labco</td><td>938W</td><td>エクセテイナーバイアル:12 mL、丸底</td></tr><tr><td>ガラス培養チューブ</td><td>ベルコガラス</td><td>2048-00150</td><td>18 x150 mm</td></tr><tr><td>LiCl 沈殿溶液 (7.5 M)</td><td>Invitrogen</td><td>AM9480</td><td></td></tr><tr><td>一方向ストップコック</td><td>VWR</td><td>MFLX30600-00</td><td>入口ポート:メス ルアー、出口ポート:オス ルアー ロック</td></tr><tr><td>ペトリ皿、正方形</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875711A</td><td>100 x 100 mm</td></tr><tr><td>リン酸バッファー、0.2 M (pH 6.8)</td><td></td><td>以下の</td> <td>CAS 番号を参照以下をMilli-Q水とオートクレーブに溶解します:12.24 g / L KH2PO4、26.29 g / L Na2HPO4 &middot;7H2O</td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>PTFEシリンジフィルターチップ</td><td>Thermo Scientific</td><td>03-050-469</td><td>疎水性、細孔径:0.2 & マイクロ;m、直径:4 mm</td></tr><tr><td>Qubit 1x dsDNA High Sensitivity Assay Kit&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>Q33230</td><td></td></tr><tr><td>量子ビット 4 蛍光光度計</td><td>Invitrogen</td><td>Q33238</td><td></td></tr><tr><td>RNA Clean &Concentrator-5</td><td>Zymo Research</td><td>R1013</td><td></td></tr><tr><td>Serum stopper</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>03-340-302</td><td>20 mm</td></tr><tr><td>シリンジ</td><td>BD Biosciences</td><td>302995</td><td>Luer-Lock, 10 mL, 使い捨て, 滅菌シ</td></tr><tr><td>リンジポンプ</td><td>New Era Pump Systems Inc.</td><td>1000-US</td><td>NE-1000 1チャンネルプログラマブル</td></tr><tr><td>SYTO9、ヨウ化プロピジウム、マイクロスフェア</td><td>Invitrogen</td><td>L34856</td><td>LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit</td></tr><tr><td>ジルコニア/シリカビーズ</td><td>BioSpec 製品</td><td>11079101z</td><td>0.1 mm 直径</td></tr><tr><td><強力>化学試薬</強力></td><td><強い>CAS番号</強い></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CaCl<サブ >2</サブ>&middot;6H2O</td><td>7774-34-7</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CoCl2&middot;6H2O</td><td>7791-13-1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>濃硫酸</td><td>7664-93-9</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CTAB、臭化セトリモニウム</td><td>57-09-0</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CuCl2&middot;2H2O</td><td>10125-13-0</td><td></td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>64-17-5</td><td></td><td>&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>FeSO4&middot;7H2O</td><td>7782-63-0</td><td></td><td></td></tr><tr><td>H3BO3</td><td>10043-35-3</td><td></td><td></td></tr><tr><td>イソプロパノール</td><td>69-63-0</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>7778-77-0</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KNO3</td><td>7757-79-1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LaCl3</td><td>10099-58-8</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&middot;7H2O</td><td>10034-99-8</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MnCl2&middot;4H2O</td><td>13446-34-9</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na2CO3、炭酸ナトリウム</td><td>497-19-8</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na2-EDTA</td><td>139-33-3</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4 & middot; 7H2O</td><td>7782-85-6</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na2MoO&middot;2H2O</td><td>10102-40-6</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl、塩化ナトリウム</td><td>7647-14-5</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NiCl2&middot;6H2O</td><td>7791-20-0</td><td></td><td></td></tr><tr><td>フェノール(90%水溶液)</td><td>108-95-2</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PVP40、ポリビニルピロリドン</td><td>9003-39-8</td><td></td><td></td></tr>トリ<tr><td>スHCl</td><td>1185-53-1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZnSO4&middot;7H2O</td><td>7446-20-0</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&beta;-メルカプトエタノール</td><td>60-24-2</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

メタン-酸素カウンターグラジエントにおけるメタン栄養生物の培養のためのアガロースベースモデル生態系

Agarose-Based Model Ecosystem for Cultivating Methanotrophs in a Methane-Oxygen Counter Gradient

ここでは、グラジエントシリンジモデル生態系を使用して、単一の菌株(メタン栄養菌 Methylomonas sp. LW13株)を栽培しました（図1A)6を行ったが、直接土壌接種によりメタン酸化微生物群集を濃縮するためにも使用できます（図1B)。メタン-酸素対向勾配の存在は、無細胞シリンジと接種シリンジ全体のメタンと酸素の濃度を測定することによって検証されました(図1C)。LW13を接種したグラジエントシリンジの場合、シリンジを洗い流してから1日以内に対向勾配が形成され、インキュベーションの3日間でスティープ化しました。同じ期間に、両方のガス基板が最低濃度に達したのと同じ深さに水平帯が形成されました(図1A)。急なガス勾配と水平バンドの深さを超えるメタンと酸素の枯渇は、LW13がメタンを好気的に代謝し、均質なプランクトン培養では観察されない表現型を生成することを示しました。この表現型は、LW136と同じ環境試料から単離された他のメタン栄養細菌によっても産生されます。異なるメタン栄養株間での水平バンドの発達のタイミングと深さの系統依存的な変動は、空間的に分解された状況で培養した場合、水平バンドが各微生物の特定の挙動によって影響を受けることを示唆しました6。
アガロースプラグ全体の細胞数は、フローサイトメトリーおよびコロニー数(CFU/mL)を用いて測定しました(図2A)。この方法を用いて、野生型LW13の細胞分布と生存率を、フコース4-O-アセチルトランスフェラーゼ(OAT)遺伝子の欠失を含むLW13の変異株と比較したが、これは以前に水平バンドの発達に影響を与えることが示されていた6。LW13のΔOAT変異体は、野生型と比較して、6日間にわたる勾配シリンジの全体的な成長が低かったが、この効果は同株の均質なプランクトン培養では観察されなかった6。この変異株は、グラジエントシリンジで培養した場合、LW13野生型と同じ明確な水平バンドを形成しませんでした(図2B)。細胞数と水平バンドの外観は、変異株の遺伝子補完により、野生型と同様のレベルに回復しました。これらの結果は、グラジエントシリンジを使用して、メタン-酸素カウンターグラジエントにのみ存在する特定の表現型に遺伝子を関連付けることができることを示しています。
さまざまな遺伝的、化学的、および分子的手法を、半固体のアガロースマトリックス内で増殖させた細菌との使用に適応させました。グラジエントシリンジモデルエコシステムは、ネガティブコントロールとして未接種アガロースを含めることで、標準的な生体分子定量アッセイに容易に使用できます。細胞外高分子物質やバイオフィルムによく見られる3つの異なる生体分子、多糖類、タンパク質、細胞外DNAの濃度を測定しました15 (図3)。LW13を接種したシリンジセグメントでは、水平バンドは他のセグメントよりも多糖類が有意に多く、タンパク質や細胞外DNAの有意な増加はありませんでした。
RNA-seqを使用して、シリンジの異なる深さで成長するLW13の転写差を測定しました。堅牢な RNA 抽出は、CTAB ベースの抽出バッファーとそれに続く従来のフェノール:クロロホルム抽出および沈殿ステップを使用して達成されました。RNA-seq解析の結果は、後に水平多糖バンドの産生に関与する遺伝子を同定するために利用されました。これらの結果は、空間分解モデル生態系の創成に不可欠な半固体アガロースが、一般にプランクトン系およびプレート系培養に限られているさらなる生化学的分析を妨げないことを示しています。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67191/67191fig01.jpg"> 図1:グラジエントシリンジモデル生態系(A)メタン栄養生物Methylomonas sp. LW13を接種したグラジエントシリンジ。シリンジを100%メタンで洗い流してから2日以内に、明確な水平バンド(矢印)が発達します。(B)10-1および10-4に希釈した土壌を接種し、2週間インキュベートしたグラジエントシリンジのクローズアップ写真。より希薄な土壌を含むグラジエントシリンジは、アガロース全体に球状のコロニーをもたらしましたが、より濃縮された土壌接種物は明確なバンドをもたらしました。(C)LW13接種および滅菌勾配シリンジの3日間のインキュベーション後のメタン-酸素対向勾配の特性評価。灰色のバーは、多糖類バンドが配置されていた深さの範囲を示します。データは、3つの独立した実験の平均±SDを示しており、それぞれに3回の技術的反復があります。パネル(A)および(C)は、Beals et al.6から改変されました。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67191/67191fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67191/67191fig02.jpg"> 図2:グラジエントシリンジでのインキュベーション後のLW13野生型および変異体の定量 (A)0日目と7日目にグラジエントシリンジから回収された押し出しアガロース1mLあたりのLW13細胞の総数をフローサイトメトリーで測定。ΔOATは、多糖バンドの深さに位置する細胞で高発現することがわかったフコース4-O-アセチルトランスフェラーゼ遺伝子の欠失を含んでいます。ΔOAT+OATは、ΔOATゲノムの遠位位置に挿入されたOAT遺伝子を含んでいます。*、有意に異なる(両側ヘテロセダスティック t検定、α = 0.05)。N.S.、大きな違いはありません。データは、3つの独立した実験の平均±SDを示しており、それぞれに2回の技術的反復があります。(B)LW13野生型、ΔOAT、またはΔOAT+OATを7日間のインキュベーション後に接種したグラジエントシリンジの水平バンド展開。この図はBeals et al.6から修正されました。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67191/67191fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67191/67191fig03.jpg"> 図3:グラジエントシリンジの深さが増す際の生体分子の定量。 LW13 を接種したグラジエントシリンジの 8 つの切片を 7 日間インキュベートした相対多糖類含量(%)、タンパク質濃度(μg/mL)、および DNA 濃度(ng/μL)(白丸は滅菌グラジエントシリンジからの値を示します)。データは、それぞれ 3 回のテクニカル反復による 3 つの独立した実験の平均 ± SD を示しています。相対多糖類含有量の場合、*は同等の深さでの滅菌コントロールとの有意差を示します(両側ヘテロセダスティック t検定、α = 0.05)。タンパク質とDNAの濃度については、*は水平バンドを含むセクションとの有意差を示します(Tukey-Kramerの事後分析による一元配置分散分析)。N.S.、重要ではありません。この図はBeals et al.6から修正されました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67191/67191fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

Aerobic methane-oxidizing bacteria, known as methanotrophs, serve important roles in biogeochemical cycling. Methanotrophs occupy a specific environmental ...

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メタン-酸素カウンターグラジエントにおけるメタン栄養生物の培養のためのアガロースベースモデル生態系

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