精密にカットされた肝臓スライスの生産と培養のための最適化および簡素化された技術

精密に切断された肝臓スライス(PCLS)を製造および培養するためのプロトコルは、大きく異なる場合があります。PCLSの主な欠点は半減期が短いことですが、ここでは、少なくとも4日間の半減期を確保しながら、ビブラトームにアクセスできる標準的な実験室条件でPCLSの製造と培養を達成できることを実証します。PCLSは、in vitroモデルとin vivoモデルの間のギャップを埋める魅力的なモデルですが、半減期が比較的短いため無視されがちです。しかし、それらは代謝の合計に不可欠なすべての細胞型と保存された構造を含んでいるため、臓器全体のミニモデルに似ており、複雑な表現型を複製しながら生組織の研究と治療を可能にします。連続スライスは非常に単純なプロセスですが、技術的に困難です。これを容易にするために、私たちのプロトコルは、切断の向きや組織の包埋などの重要なステップに焦点を当てていますが、培養のためのミニモデルボリュームと半減期を延ばすための動的システムの関連性にも焦点を当てています。

[ナレーター]収穫前に、1リットルのKrebs-Henseleitバッファー、消毒および冷却したビブラトームトレイ、オートクレーブ滅菌したビブラトームブレード、および4%低融点アガロースを準備します。収穫当日は、溶かしたアガロースを37°Cの水浴で使用まで保管してください。次に、ウェルあたり2.6、1.5、および0.7ミリリットルの完全培地をそれぞれ6ウェル、12ウェル、および24ウェルプレートに追加して、培養プレートを調製します。8マイクロメートルの多孔質インサートを各ウェルに挿入します。プレートを、5%の二酸化炭素と21%の酸素で摂氏37度に設定した加湿インキュベーターに入れます。適切な滅菌方法を使用して、収穫に必要なすべての器具を滅菌します。安楽死させたマウスの腹部に70%エタノールをスプレーして、その領域を消毒します。滅菌鉗子とはさみを使用して、腹部の中央から皮膚と腹膜を切り取り、腹腔を開きます。肝葉の損傷を避けながら、周囲の臓器や血管から肝臓を優しく解剖します。次に、肝臓全体をすぐに氷冷のクレブス緩衝液に保管します。鈍い鉗子と鋭利で滅菌されたナイフまたはハサミを使用して、分離中にローブを損傷しないように、各ローブを個別に分離します。鋭利で滅菌済みのナイフを使用して、選択したローブのすべてのエッジをトリミングして、埋め込み用のまっすぐで扱いやすいエッジを作成します。次に、4%の低融点アガロースを湿った氷の上に置いた3センチメートルのペトリ皿に注ぎ、均一に冷却し、葉が沈むのを防ぎます。アガロースをさらに30秒間冷まし、トリミングしたローブをアガロースの中央に置き、ブロックの中央に沈殿させます。次に、アガロースブロックの外側の端を切り取り、アガロースブロックを皿から取り除きます。上面とビブラトームプラットフォームに接着された側面がローブの上端と平行であることを確認します。まず、ビブラトームを 250 マイクロメートルの厚さで、速度 5 ヘルツ、周波数 7 ヘルツで切断するように設定します。ビブラトームを滅菌し、トレイをビブラトームの上に置いた後、氷で囲んで環境を冷たく保ちます。ブレードを水平面から10度下向きに設定します。次に、ビブラトームタンクに氷冷のクレブスバッファーを入れます。シアノアクリレート接着剤をプラットフォームに薄く塗布して、アガロースブロックを取り付ける準備をします。その後、滅菌吸収性組織を使用してプラットフォームに接着するアガロースブロックの端を乾燥させます。次に、アガロースブロックをビブラトームの取り外し可能なプラットフォームに置きます。肝葉を直立させて横方向の切断を可能にすると、肝葉への圧力が軽減され、よりスムーズな切断が容易になります。接着剤が固まるまで 1 分間待ち、プラットフォームをビブラトーム タンクに沈め、アガロース ブロックがクレブス緩衝液で完全に覆われていることを確認します。切断用にビブラトームをプログラムするには、開始位置と停止位置を設定します。次に、肝葉に達するまでスライスを切り始めます。鉗子やブラシとは異なり、損傷を避けるため、へらを使用して肝臓のスライスを集めます。培養の準備が整うまで、氷冷のクレブスバッファーにスライスを集めます。へらを使用して、肝臓スライスを培地とインサートを含む準備されたウェルに移します。次に、プレートを130rpmに設定したオービタルシェーカーに置き、5%の二酸化炭素と21%の酸素を含む摂氏37度の従来の細胞培養インキュベーターでインキュベートします。