Name: 精密にカットされた肝臓スライスの生産と培養のための最適化および簡素化された技術 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-22T14:10:00.000+00:00
Duration: 6 min
Description: 学ぶ精密カット肝臓スライス（PCLS）の製造と培養法。マウス肝臓を用い、バイブロトームでスライスし、4日以上生存可能な培養系を確立。代謝研究や薬物応答解析に有用なモデルです。

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<meta charset="utf8"></head><body>基本的な実験室環境での肝臓スライスの培養のための標準化されたプロトコル

<table><tbody><tr><td>3cmシャーレ</td> 細胞<td>培養に適</td><td>したもの</td><td></td></tr><tr><td>6、12、24ウェル培養プレート</td> 細胞<td>培養に適したもの</td><td></td><td></td></tr><tr><td>シアノアクリレート瞬間接着剤</td><td></td> D<td></td><td></td></tr><tr><td>-グルコース</td><td>Gibco</td><td>A24940</td><td></td></tr><tr><td>エオシン</td><td>メルク</td><td>HT110316</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>ThermoFisher</td><td>26400044</td><td></td></tr><tr><td>ゲンタマイシン&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15750060</td><td></td></tr><tr><td>ヘマトキシリン</td><td>Merck</td><td>51275</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>インサート 8um、12 ウェルプレート用</td><td>Strastedt</td><td>83.3931.800</td><td></td></tr><tr><td>インサート 8um、24 ウェルプレート用</td><td>Strastedt</td><td>83.3932.800</td><td></td></tr><tr><td>インサート 8um、6 ウェルプレート用</td><td>Strastedt</td><td>83.3930.800</td><td></td></tr><tr><td>KREBS</td><td>Merck</td><td>K3753</td><td></td></tr><tr><td>層流フード</td><td></td><td></td><td>Hepa 空気ろ過</td></tr><tr><td>低融点アガロース&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>16520050</td><td></td></tr><tr><td>MTS テトラゾリウム試薬&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab197010</td><td></td></tr><tr><td>マルチウェルプレートリーダー&nbsp;</td><td>任意の</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS錠</td>剤 <td>ThermoFisher</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>メスの刃</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>任意の外科用鉗子</td> 平<td>らな四角い先端を備えた</td><td>もの。</td><td></td></tr><tr><td>手術用ハサミ</td><td>Any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1000 S</td><td></td></tr><tr><td>William's ミディアム E (GlutaMAX (WME)を含む</td>サー<td>モフィッシャー</td><td>W4125</td><td></td></tr></tbody></table>

精密にカットされた肝臓スライスの生産と培養のための最適化および簡素化された技術

Optimized and Simplified Technique for the Production and Culture of Precision-Cut Liver Slices

収穫時には、臓器の迅速な処理を確保し、臓器の損傷を防ぐために、動物の灌流は意図的に省略されます。肝臓は切開後すぐに抽出され、すぐに氷のように冷たい臓器保護緩衝液、例えば、クレブス緩衝液24,29に入れられます。埋め込まずに新鮮な肝臓組織をスライスすることは以前に説明されていますが1、低融点のアガロース30(図1)に肝臓を埋め込み、臓器保護バッファーと組み合わせることで、ビブラトーム上での最適な切断条件が可能になり、組織の損傷が軽減され、切片の厚さの再現性が向上します。薄い切片は、より多くの細胞層が栄養素と酸素31にアクセスし、細胞死を減らすことを可能にするため、組織の厚さは重要です。しかし、薄すぎる切片は均一に切断するのが難しくなります。逆に、400μmより厚いスライスは、栄養素の浸透率が低くなります。切片をインサート(図1)を用いて液体-空気界面でインキュベートし、シェーカー上で37°Cで5%CO2および21%O2とインキュベートしました。切片は、収穫後3時間以内に培地中でインキュベートし、その後、細胞死が急速に起こる32。
PCLSの生存率を決定するために、細胞生存率は4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-5-(3-カルボキシメトキシフェニル)-2-(4-スルホフェニル)-2H-テトラゾリウム(MTS)アッセイによって評価されました。これには、NAD(P)H依存性デヒドロゲナーゼ、すなわち代謝活性細胞が必要です。MTS値は、それぞれのスライス重量に正規化されています。PCLSの生存率を最適化するためには、24時間のインキュベーション後も生存率を維持するために、最小限の量の培地が不可欠でした。24ウェルプレート中の0.7 mLの容量は、TMSアッセイによる生存率の有意な低下を示しました(p = 0.02)12ウェルプレートで1.5 mL、6ウェルプレートで2.6 mL(図2A)。これらのボリュームは、セクションをわずかに覆うことができるように選択されていますが、使用するインサートやプレートのタイプによっては調整が必要な場合があります。他の33と同様に、12ウェルプレートは、少量の培地内で最適な生存のための最良の妥協点として使用されます。
振とうは必須であり、インキュベーション後24時間でPCLSの生存率が静止培養と比較して50%向上します(図2B)。振とうと、トランズウェルを使用して最適化された重要な気液界面が作成され、セクションの両面に栄養素と酸素へのアクセスが可能になります。酸素と栄養素の取り込みは、振とう動作によって生成される一定の流れによっても増加し、それはトランズウェル膜も通過します。
MTS アッセイは、1 時間のインキュベーションからインキュベーションの 6 日目まで評価しました。細胞生存率はインキュベーション後0日目から4日目まで一定でしたが、6日目に有意な減少(p = 0.05)が観察されました(図2C)。ヘマトキシリンおよびエオシン(H&amp;E)染色によって評価されたPCLS形態は、インキュベーション後5日まで胆管および構造の変化を示さなかった(図3A-D)。0日目(図3A)と比較して、PCLSはインキュベーション後1日目(図3B)および2日目(図3C)に組織学的差を示さず、核高色素性、軽度の炎症性浸潤、空胞化により、インキュベーション後5日目に中等度の細胞死プロセスを支持しました(図3D)。まとめると、このPCLS培養プロトコルは、同様の条件でスライスを使用した研究と一致して、少なくとも4日間の生存率を可能にする31。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67202/67202fig01.jpg"> 
図1:PCLSを生成するためのプロトコルをまとめた概略図。 この数値は34から変更されています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67202/67202fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67202/67202fig02.jpg"> 
図2:PCLS培養の最適化されたプロトコルは、5日間で十分な生存率を示しています。 (A)ウェルサイズが細胞増殖に及ぼす影響(n = 3)。(B)細胞増殖に対する振とうの影響(条件あたりn = 6)。(C)インキュベーションのd0からd6日までの肝臓切片からのMTS細胞増殖アッセイ(n=5/時点)。OD任意の単位、新鮮な重量をスライスするように正規化。グラフは平均±SDを示しています。対応のない両側スチューデントのt検定、ns=有意ではない、*p&lt;0.05、**p&lt;0.01。この数値は34から変更されています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67202/67202fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67202/67202fig03.jpg"> 
図3:組織学の結果。 (A-D)H&amp;E染色後の肝臓PCLSの組織学の代表的な画像。スケールバー = 100 μM。この数値は34から変更されています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67202/67202fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

This protocol presents a simple system for the creation and culture of Precision-cut Liver Slices (PCLS). PCLS contains all cells in an intact environment ...

optimized-simplified-technique-for-production-culture-precision-cut

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JoVE Journal

Biology

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