乳酸菌における媒介細胞外電子移動の特性評価 3電極2チャンバー生体電気化学システムによる

私たちの研究室では、食品業界で重要な発酵性細菌であるlactiplantibacillus plantarumのような細菌の細胞外電子移動(EET)を調査しています。EETでは、細胞は生体電気化学システムの電極のように、電子を細胞外の電子セプターに伝達します。私たちは、バイオセンシング、生体触媒、食品発酵の応用のためのEETを理解し、設計したいと考えています。

アルパイントンネルは、DHNAなどのキノンの存在下でEETを通じて電流を購入できることを発見しました。このプロセスはNAD plusを再生し、一次発酵経路の全体的な損失を加速し、細胞増殖を促進します。さらに、DHNA以外の多様なキノン誘導体も、L plantarumのEETを媒介できることが分かった。

媒介性EETの調査には、専門的な生化学的なセットアップが必要です。具体的には、陽極反応と陰極反応の間のクロストークを防ぐために、3電極、2チャンバーの生体電気化学システムを使用します。また、電子メディエーターからの電子移動を促進するために、表面積の大きい作用電極である炭素場を使用しています。

L plantarumのEET経路と、それらの経路が発酵代謝とどのように相互作用するかを調査する私たちの研究は、食品業界で有用な応用が期待できます。EETとL plantarumは発酵を通じて代謝フラックスを変化させることが分かっており、それを有用な用途に利用したり、食品の風味を変えたり、電気発酵で貴重な化学物質を生成したりするために操作できる可能性があります。今後は、EETの基礎知識を増やし、L plantarumのような生物種への新規なEET応用を追求していきます。

私たちは、EET経路でタンパク質を操作することを計画しており、これにより、電気発酵やバイオセンシングへの応用のためにEETをさらに制御できるようになります。まず、対電極での作業用に直径1ミリメートルのチタンワイヤーを事前にカットし、酸化アルミニウムのサンドペーパーで均一に光沢が出るまで研磨します。ペンチを使用して、各作用電極ワイヤーの一方の端を小さなフックに曲げます。

16平方センチメートルのカーボンフェルトを各作用電極ワイヤーにスライドさせ、カーボンフェルトのワイヤーを一度丸く出し入れし、フックに固定されるまでワイヤーに丸く引き下げます。ゴム製のセプタムにワイヤーを突き刺し、数センチメートル引っ張って、作業用エンカウンター電極をGL 45キャップに固定します。ペアリアクターを構築するには、Oリングを組み立て、組み立てたOリングに事前に水に浸したプレカット陽イオン交換膜を配置します。

2つのペアのリアクターボトルの大きな底の開口部の間にメンブレンを備えたOリングを配置します。リアクターペアボトルとリングをナックルクランプでメンブレンに固定します。各ボトルの上部にあるすべての小さな開口部を閉じる前に、各陽極チャンバーにマグネティックスターバーをドロップし、ゴム製のセプタムが取り付けられたGL14キャップで閉じます。

各リアクターボトルに110ミリリットルの脱イオン水を入れます。カーボンフェルト丸型作動電極を取り付けたキャップを挿入し、フェルト丸型の上部をそっと押してフックに固定します。適切な電極が取り付けられたGL45キャップでボトルを閉じます。

オートクレーブ水入り反応器とGL14電極キャップ。無菌条件下で、グリセロールストックの上部からラクトプラントアバジリスクプランタルム培養物をこすり落とし、3ミリリットルの市販のルゴサシャープまたはMRS培地に接種します。培養物を振らずに摂氏37度で一晩インキュベートします。

まず、滅菌済みのバイオセーフティキャビネットで、バイオ電気化学システムリアクターからオートクレーブされた水を廃棄します。陰極室に110ミリリットルのオートクレーブ処理されたM9中型チャンバーと110ミリリットルの新たに調製されたMCDMの陽極チャンバーを充填します。陽極チャンバーのGL14キャップを1つ、シリコン製シーリングリング付きのオートクレーブGL14キャップに交換します。

調製した参照電極に70%エタノールをスプレーしてから、電極キャップを介して各陽極チャンバーに配置します。すべてのキャップとclを締めますamp 漏れないように。リアクターをウォーターポンプシステムに取り付けるには、まず、各リアクターを適切な攪拌子プラットフォームに置きます。

次に、各原子炉のウォータージャケットスピゴットをゴムチューブで次の原子炉に接続し、エンドリアクターをウォーターポンプの流入管と流出管に接続します。ポンプに水を入れ、ウォーターコンディショナーを4〜6滴加えます。ポンプシステムをオンにし、温度を摂氏30度に設定します。

ポンプを始動し、すべての原子炉ウォータージャケットを通る水の流れを観察し、漏れがないことを確認します。攪拌プラットフォームの電源を入れ、220RPMで連続攪拌するように設定します。リアクターを窒素スペアガスラインに取り付けるには、まず、エアフィルターを22ゲージの針に取り付け、リアクター陽極チャンバーの上部セプタムからメディアに針を挿入します。

原子炉陽極チャンバーの上部セプタムに18ゲージの針を挿入し、窒素源からのガスラインをエアフィルターに接続し、バルブを開いてガスが反応器を穏やかに泡立つようにします。バイオリアクターをポテンショスタットリードに取り付けるには、ポテンショスタットからのワーキングカウンターと参照電極のワニ口クリップリードを対応する電極に接続します。すべてのパラメータを入力したら、緑色の開始三角形を押して実行を開始します。

開回路の電圧トレースを数分間観察して、すべてのリアクタが確実に読み取られることを確認します。そして安定した信号で一緒に閉じます。無菌条件下で、以前に成長させたL plantalumを50ミリリットルのMMRSで1〜200培地に継代培養します。

細胞を振らずに摂氏37度で一晩成長させます。まず、MMRSで培養したLプランタルム培養物をインキュベーターから取り出します。無菌条件下で培養物を50ミリリットルの円錐形チューブに移し、チューブを氷の上に置きます。

培養物を4, 000 Gで摂氏4度で5分間遠心分離します。ペレットを50ミリリットルのPBSに再懸濁する前に、上清を取り除きます。2回目の洗浄後、細胞を冷PBS中に600ナノメートルの11の光学密度に再懸濁します。

2ミリリットルの再懸濁細胞を、針を取り付けた3ミリリットルの注射器にロードします。リアクターステーションで、セルシリンジのキャップを外し、リアクター陽極チャンバーの上部に針を挿入します。すべてのシリンジが所定の位置に配置されたら、プランジャーを押し下げて細胞を注入します。

クロノアンペロメトリートレースから注入時間を記録します。トレース上の電流が2〜4時間安定するまで待ちます。生体電気化学システムでは、実験用リアクターをプラスDHNAとラベル付けし、溶媒制御リアクターをマイナスDHNAとラベル付けします。

110マイクロリットルの20ミリグラム/ミリリットルのDHNAを装填した注射器をデキャップし、プラスDHNAとして指定された陽極チャンバーの上部に挿入します。110マイクロリットルのDMSOを装填したシリンジを、マイナスDHNAとして指定された陽極チャンバーに挿入します。21ゲージの針を取り付けた3ミリリットルのシリンジを使用して、未使用のスモールキャップセプタムを通じて各陽極チャンバーから2ミリリットルのメディアを取り出します。

サンプルを24ディープウェルプレートに移し、ゼロ時間時点のpHを測定します。DHNAおよびDMSOシリンジのプランジャーを押し下げて、リアクターに注入します。クロノアンペロメトリートレースから注入時間を記録します。

すべての注射器と針を廃棄します。24時間後、前述のように各陽極チャンバーから2ミリリットルの培地を取り出し、24時間のpH測定のために24ディープウェルプレートに移します。24時間時点のサイクリックボルタンメトリーを実行します。

各反応器からの24時間サンプルのpHを測定し、記録します。細胞外電子移動による電流密度は、DHNA注入の8時間後に1平方センチメートルあたり約132マイクロアンペアのピークに達しました。対照的に、DMSOインジェクションでは、電流密度はごくわずかでした。

サイクリックボルタンメトリーのデータは、DHNAを搭載したLプランタルムの存在下で、DMSOを使用したLプランタルムと比較して、50ミリボルトでの酸化電流の明確な増加を示し、非生物的DHNAトレースと比較して、300ミリボルトでの電流密度が256%増加することを示しました。細胞外電子移動により、L plantarumとDHNAを含むサンプルでは24時間で平均3.33までpHが著しく低下しましたが、L plantarumとDMSOを含むサンプルの平均pHは6.50でした。