Name: ヒトアデノシンデアミナーゼ1酵素の血清安定性の測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-27T14:25:00.000+00:00
Duration: 4 min 17 s
Description: 学ぶ血清中酵素安定性評価法を用いたヒトアデノシンデアミナーゼ1の機能解析。タンパク質工学とがん治療における薬物動態プロファイルの予測に役立つ技術です。

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1. 血清インキュベーション
<ol><li>最終濃度10 μMで1x PBS pH 7.4 (1x PBS)中のHsADA1の10倍ストックを調製し、プールしたヒト血清の15 mLアリコートを解凍し、37°Cに予熱します。 1x PBSの50 mLアリコートを37°Cに予温します。</li>
	<li>酵素+血清混合物と呼ばれる低結合微量遠心チューブで、10x HsADA1ストック100 μLをプールしたヒト血清900 μLを加えて、酵素-血清インキュベーション混合物を調製します。別の低結合微量遠心チューブで、10x HsADA1ストック100 μLを1x PBSストック900 μLに加えて、酵素+1x PBS混合物と呼ばれる非血清コントロールと比較します。各混合物中のHsADA1の最終濃度は1μMになります。</li>
	<li>100 μL の 1x PBS と 900 μL のプールされたヒト血清を混合した低結合マイクロ遠心チューブで、追加のコントロールを調製します。これは、酵素+血清混合物の非酵素制御として機能します。さらに、1 mLの1x PBSからなるコントロールを作成します。これは、酵素+ 1x PBS混合物の非酵素制御として機能します。</li>
	<li>ステップ1.2の各混合物100 μLを別々の低結合チューブに分注し、1x PBSで30%(v / v)グリセロール100 μLで1:1に希釈します。液体窒素で急速凍結し、-80°Cで保存します。 これらのサンプルは Day 0 の時点であり、サンプル中の HsADA1 の濃度は 500 nM になります。1.3の非酵素制御混合物について、この手順を繰り返します。すべての酵素とコントロール混合物を透明フィルムで密封し、37°Cのインキュベーターに入れます。</li>
	<li>24時間後、インキュベートした各サンプル100 μLを分量し、1x PBSで30%(v / v)グリセロール100 μLで1:1に希釈します。液体窒素で急速凍結し、-80°Cで保存します。 これらのサンプルは Day 1 の時点になります。すべての酵素およびコントロール混合物を37°Cインキュベーターに戻します。この手順を 72 時間と 120 時間で繰り返します。 注:分注サンプルは、必ずしも急速冷凍する必要はありません。あるいは、各サンプルを採取した直後にマイクロプレートベースのアッセイを実施することもできますが、サンプルを試験するたびに新鮮な標準曲線とアデノシン基質ストックを調製する必要があります。</li>
</ol>2. マイクロプレートを用いたアッセイ
<ol><li>マイクロプレートリーダーを準備するには、キネティックリードプロトコル(図2)を設定して、最短の読み取り間隔30分で260nmの吸光度を測定し、リーダーを37°Cの設定値に予熱します。</li>
	<li>収集したすべてのサンプルを氷上で解凍します。37°Cに予熱した1x PBSを低結合微量遠心チューブの希釈剤として使用して、解凍した各サンプルを1:10に希釈します。これらのサンプル中の新しいHsADA1濃度は50 nMになります。</li>
	<li>非酵素血清コントロールサンプルから1x PBSに10倍希釈します。さらに、50 mLの1x PBSに66.8 mgのアデノシンを添加して、5 mMのアデノシンストックを調製します。1x PBSの7,600 μLに400 μLのアデノシンストックを加えて、250 μMのアデノシン希釈液を調製し、インキュベーターで37°Cに予温します。</li>
	<li>96ウェルUV適合マイクロプレートに、250 μMのアデノシン希釈液160 μLと希釈したタンパク質サンプル40 μLを三重に添加して、総容量200 μLにします。これにより、最終的なアデノシン濃度は200 μM、最終的な酵素濃度は10 nMになります。</li>
	<li>希釈した血清または1x PBSコントロール40 μLと250 μMアデノシン希釈液160 μLを三重に添加して、コントロールサンプルの希釈を繰り返します。これにより、最終的なアデノシン濃度は200 μMになりますが、酵素は含まれていません。 注:最初にすべての希釈酵素サンプルとコントロールサンプルをマイクロプレートに個別に追加し、次に12チャンネルマイクロピペットでアデノシン基質を追加すると、合計ロード時間を短縮できます。さらに、このステップでは、プレート自体が測定された吸光度信号と交絡するのを防ぐために、UV透過性プレートを使用する必要があります。</li>
	<li>260 nmで各ウェルの吸光度を37°Cで30分間測定します。 完了したら、データをスプレッドシートにエクスポートして、さらに分析します。</li>
</ol>3. マイクロプレートリーダーデータの解析
<ol><li>吸光度データの最初の数分間の時間の関数として、吸光度データの線形領域の傾きを決定します。血清希釈サンプルの場合、これは最初の~120秒に対応しました。1x PBS希釈サンプルの場合、これは最初の~270秒に相当します。この減衰吸収値の傾きは負の数値を持ち、1 秒あたりの吸光度単位 (ΔA260/s) の変化単位を持ちます。</li>
	<li>プールされたヒト血清からなるネガティブコントロールの傾きを、酵素+血清データの傾きから差し引きます。酵素 + 1x PBS混合物に対して、1x PBSコントロールの傾きを差し引いて同じ操作を行います。</li>
	<li>調整されたすべての傾きを t=0 h の元の傾きに正規化し、式 1 を使用して残りの活動の割合を求めます。 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67216/67216eq01.jpg" style="margin: auto;">数式 1</li>
	<li>残りのアクティビティの割合と時間をプロットします。</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>HsADA1の血清安定性の評価:マイクロプレートベースのアプローチ

<ol><li>Valero, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+serum-stable+RNA+aptamer+specific+for+SARS-COV-2+neutralizes+viral+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A serum-stable RNA aptamer specific for SARS-COV-2 neutralizes viral entry.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (50), e2112942118(2021).</li>
<li>Iannuzo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+identifies+synthetic+peptides+with+antibacterial+activity+against+mycobacterium+abscessus+and+serum+stability%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Omega%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening identifies synthetic peptides with antibacterial activity against mycobacterium abscessus and serum stability.</a> ACS Omega. 7 (27), 23967-23977 (2022).</li>
<li>Ma, M. T., Jennings, M. R., Blazeck, J., Lieberman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catalytically+active+holo+homo+sapiens+adenosine+deaminase+i+adopts+a+closed+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallograph+Sect+D%22%5BJournal%5D)">Catalytically active holo homo sapiens adenosine deaminase i adopts a closed conformation.</a> Acta Crystallograph Sect D. 78 (1), 91-103 (2022).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+4+nucleosides+via+one+reference+compound+in+chinese+cordyceps+by+hplc-uv+at+equal+absorption+wavelength%5BTitle%5D)+AND+%22Natural+Prod+Comm%22%5BJournal%5D)">Determination of 4 nucleosides via one reference compound in chinese cordyceps by hplc-uv at equal absorption wavelength.</a> Natural Prod Comm. 18 (3), 1934578X231161410(2023).</li>
<li>Whitmore, K. V., Gaspar, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenosine+deaminase+deficiency+-+more+than+just+an+immunodeficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Adenosine deaminase deficiency - more than just an immunodeficiency.</a> Front Immunol. 7, 314(2016).</li>
<li>Jennings, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+expression+and+purification+of+a+human+adenosine+deaminase+in+E.+coli+and+characterization+of+its+asp8asn+variant%5BTitle%5D)+AND+%22Prot+Express+Purificat%22%5BJournal%5D)">Optimized expression and purification of a human adenosine deaminase in E. coli and characterization of its asp8asn variant.</a> Prot Express Purificat. 213, 106362(2024).</li>
<li>Blazeck, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bypassing+evolutionary+dead+ends+and+switching+the+rate-limiting+step+of+a+human+immunotherapeutic+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Catalysis%22%5BJournal%5D)">Bypassing evolutionary dead ends and switching the rate-limiting step of a human immunotherapeutic enzyme.</a> Nat Catalysis. 5 (10), 952-967 (2022).</li>
<li>Lu, J., Grenache, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+rapid%2C+microplate-based+kinetic+assay+for+measuring+adenosine+deaminase+activity+in+body+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Clinica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Development of a rapid, microplate-based kinetic assay for measuring adenosine deaminase activity in body fluids.</a> Clinica Chimica Acta. 413 (19), 1637-1640 (2012).</li>
<li>Maciel, L. G., Dos Anjos, J. V., Soares, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+low-cost+evaluation+of+hydroxykynurenine+activity%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">Fast and low-cost evaluation of hydroxykynurenine activity.</a> MethodsX. 7, 100982(2020).</li>
<li>Bokman, A. H., Schweigert, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-hydroxyanthranilic+acid+metabolism.+Iv.+Spectrophotometric+evidence+for+the+formation+of+an+intermediate%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">3-hydroxyanthranilic acid metabolism. Iv. Spectrophotometric evidence for the formation of an intermediate.</a> Arch Biochem Biophys. 33 (2), 270-276 (1951).</li>
<li>Tanford, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTanford%2C+C+%22Advances+in+protein+chemistry%22">Advances in protein chemistry</a>. 23, Academic Press. 121-282 (1968).</li>
<li>Tritsch, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validity+of+the+continuous+spectrophotometric+assay+of+kalckar+for+adenosine+deaminase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Validity of the continuous spectrophotometric assay of kalckar for adenosine deaminase activity.</a> Anal Biochem. 129 (1), 207-209 (1983).</li>
<li>Gracia, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+catalytic+site+structural+gate+of+adenosine+deaminase+allosterically+modulates+ligand+binding+to+adenosine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">The catalytic site structural gate of adenosine deaminase allosterically modulates ligand binding to adenosine receptors.</a> FASEB J. 27 (3), 1048-1061 (2013).</li>
<li>Kalckar, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+spectrophotometry+of+purine+compounds+by+means+of+specific+enzymes%3A+Iii.+Studies+of+the+enzymes+of+purine+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bio+Chem%22%5BJournal%5D)">Differential spectrophotometry of purine compounds by means of specific enzymes: Iii. Studies of the enzymes of purine metabolism.</a> J Bio Chem. 167 (2), 461-475 (1947).</li>
<li>Hartwick, R., Jeffries, A., Krstulovic, A., Brown, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+assay+for+adenosine+deaminase+using+reverse+phase+high+pressure+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatographic+Sci%22%5BJournal%5D)">An optimized assay for adenosine deaminase using reverse phase high pressure liquid chromatography.</a> J Chromatographic Sci. 16 (9), 427-435 (1978).</li>
<li>Paul, M. K., Grover, V., Mukhopadhyay, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Merits+of+hplc-based+method+over+spectrophotometric+method+for+assessing+the+kinetics+and+inhibition+of+mammalian+adenosine+deaminase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatography+B%22%5BJournal%5D)">Merits of hplc-based method over spectrophotometric method for assessing the kinetics and inhibition of mammalian adenosine deaminase.</a> J Chromatography B. 822 (1), 146-153 (2005).</li>
<li>Ubbink, J. B., Vermaak, W. J. H., Bissbort, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-performance+liquid+chromatographic+assay+of+human+lymphocyte+kynureninase+activity+levels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatography+B%3A+Biomed+Sci+Appl%22%5BJournal%5D)">High-performance liquid chromatographic assay of human lymphocyte kynureninase activity levels.</a> J Chromatography B: Biomed Sci Appl. 566 (2), 369-375 (1991).</li>
<li>Tsentalovich, Y. P., Snytnikova, O. A., Forbes, M. D. E., Chernyak, E. I., Morozov, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photochemical+and+thermal+reactivity+of+kynurenine%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Photochemical and thermal reactivity of kynurenine.</a> Exp Eye Res. 83 (6), 1439-1445 (2006).</li>
<li>Demain, A. L., Vaishnav, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+recombinant+proteins+by+microbes+and+higher+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Adv%22%5BJournal%5D)">Production of recombinant proteins by microbes and higher organisms.</a> Biotechnol Adv. 27 (3), 297-306 (2009).</li>
<li>Gräslund, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+production+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Protein production and purification.</a> Nat Methods. 5 (2), 135-146 (2008).</li>
<li>Faber, M. S., Whitehead, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Data-driven+engineering+of+protein+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Data-driven engineering of protein therapeutics.</a> Curr Opin Biotechnol. 60, 104-110 (2019).</li>
<li>Das, S., Zhao, L., Elofson, K., Finn, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+stabilization+by+virus-like+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Enzyme stabilization by virus-like particles.</a> Biochemistry. 59 (31), 2870-2881 (2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>アデノシン&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9251-25G</td><td>25 g</td></tr><tr><td>BioTek Synergy HT マイクロプレートリーダー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf LoBind 微量遠心チューブ: タンパク質&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td>13-698-795</td><td>2 mL</td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>フィッシャー サイエンティフィック&nbsp;</td><td>G33-4</td><td>4 L</td></tr><tr><td>HsKYNase66-W102H-T333N</td><td>社内</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ヒト血清、プールされた</td><td>MP Biomedicals</td><td>92931149</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>ヒドロキシ-キヌレニン</td><td>ケイマン ケミカルズ</td><td>27778</td><td></td></tr><tr><td>イノシン&nbsp;</td><td>TCI</td><td>I0037</td><td>25 g</td></tr><tr><td>PBS、1x&nbsp; pH 7.4+/- 0.1</td><td>コーニング</td><td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>ピリドキサール 5-リン酸一水和物、99%&nbsp;</td><td>Thermo Scientifc</td><td>228170010</td><td>1 g</td></tr><tr><td>UV-STAR マイクロプレート、96 WELL、COC、F-BOTTOM</td><td>Greiner Bio</td><td>&nbsp;</td><td></td>655801</tr><tr><td>野生型ヒトアデノシンデアミナーゼ1</td><td>自社</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>製

ヒトアデノシンデアミナーゼ1酵素の血清安定性の測定

Determining the Serum Stability of Human Adenosine Deaminase 1 Enzyme

図は、野生型HsADA1で実施した場合のアッセイ実行結果を示しています。 図3A、B は、アデノシン添加後の野生型HsADA1の1x PBS/血清-酵素混合物に由来するサンプルの260 nmでの吸光度低下曲線を示しています。この時間データの関数としての吸光度の低下は、マイクロプレートベースのアッセイが成功裏に完了したときにユーザーが期待するものであり、アデノシンに十分な量の機能的HsADA1を添加した後に生じる吸光度データに似ています。 図3C、D は、アデノシン添加後に酵素を含まない試験したネガティブコントロールの吸光度曲線を示しています。実際の酵素サンプルと比較すると、これらのネガティブコントロールの吸光度変化はほとんど無視できます。 図3から、酵素曲線の傾きはインキュベーション時間の関数として変化することがわかります。たとえば、Day 0 のタイムポイントの傾きは、Day 5 のタイムポイントよりも大幅に急です。
図4 は、野生型HsADA1が保持する活性の割合を、1x PBSまたはプールしたヒト血清で37°Cでインキュベートした場合の時間の関数として示しています。 具体的には、 図 3A、B のすべての吸光度低下曲線の傾きは、それぞれのグループの Day 0 傾きに正規化されています。 図4に見られるように、1x PBSの野生型HsADA1の保持活性は、プールされたヒト血清とでは異なります。具体的には、この酵素はプールされたヒト血清中でその活性をより早く失い、酵素は5日目に元の活性の約10%を保持します。HsADA1を1x PBSでインキュベートすると、活性の損失は依然として検出可能ですが、酵素はその活性の約75%を保持しています。これはJenningsらの結果と一致しており、37°Cの血清とインキュベートした後の活性が48時間後に約40%減少したことも報告されています6。Luらはまた、HsADA1活性が周囲温度(25°C)で胸膜、腹膜、および脳脊髄の体液で低下することを示しました8。
このプロトコルの柔軟性を実証するために、我々はこのプロトコルを使用して、ヒト由来の別の酵素である、以前はHsKYNase66-W102H-T333N7と呼ばれていた遺伝子操作されたヒトキヌレニナーゼ変異体の血清安定性を試験しました。HsKYNase66_W102H-T333Nは、野生型HsKYNase酵素と同様に、OH-KynのOH-AAへの変換を効率的に触媒しますが、実際には、基質特異性が変更された、つまりキヌレニンをアントラニル酸7に効率的に分解する、改変されたヒトキヌレナーゼ変異体の2アミノ酸回帰変異体です。OH-Kynは379 nmで強く吸収しますが、OH-AAは吸収しないため、OH-kyn 9,10に当社の遺伝子操作されたHsKYNaseバリアントを添加すると、測定可能な吸光度が低下します。図5A、Bは、OH-Kynの添加後のHsKYNaseの1x PBS/血清-酵素混合物に由来するサンプルの379nmでの吸光度低下曲線を示しています。図5C、Dは、酵素を含まない試験済みコントロールの吸光度曲線を示しています。HsADA1で見られるように、サンプル間で吸光度曲線の傾きには明らかな違いがあります。これは、図 5A で特に顕著で、0 時間のタイムポイントの傾きは 3 時間や 24 時間のタイムポイントよりもはるかに急です。 図6は、試験したHsKYNaseについて保持される活性の対応する割合を時間の関数として示しています。HsADA1と同様に、HsKYNase66-W102H-T333NはPBSよりも早く血清中で活性を失います(24時間経過で~40%の活性が失われるのに対し、~85%の活性が失われます)。この酵素バリアントの血清安定性は以前にテストされていませんが、他のHsKYNaseバリアントと同様に一般的な傾向に従っており、これも37°C7の血清中で24時間以内に活性の大部分を失いました。 
一般的に言えば、酵素は、pH、塩濃度、温度などの多くの要因により、時間の経過とともに活性を失う可能性があります11。したがって、この傾向に従わない結果は異常と見なされる可能性があります。例えば、酵素活性が時間の経過とともに急激に増加する場合、結果が無効であることを示している可能性があります。これは酵素の条件が変わらないことを前提としており、厳密には時間的な意味で話しています。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67216/67216fig01.jpg"> 図1:HsADA1のプロトコルの手順を詳述したフローチャート。 次の図は、このプロトコルで従う手順を示しています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/67216fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67216/67216fig02.jpg"> 図2:マイクロプレートリーダーのキネティックリード設定。 260 nm での吸光度を 37 °C で 30 分間、最小間隔で測定するための速度論的読み取りプロトコルを作成しました。この図は、このプロトコルを設定するために選択された設定を示しています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/67216fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67216/67216fig03.jpg"> 図3:200 μMアデノシン添加後のHsADA1の吸光度対時間曲線 (A)200 μMアデノシン添加後の血清インキュベートHsADA1の吸光度対時間曲線。(B)1x PBSインキュベートHsADA1。(C)血清陰性コントロール。.(D)1x PBSネガティブコントロール(n = 3)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/67216fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67216/67216fig04.jpg"> 図4:HsADA1アクティビティの保持。 この活性は、37°Cで1x PBSとプールされたヒト血清で評価されます。 1x PBSでインキュベートしたHsADA1とプールしたヒト血清を5日間にわたって保持した元の活性の割合を決定しました(バー=平均±SD、n=3)。両側の不対応t検定は、*p&lt;0.05、**p &lt; 0.01、および***p &lt; 0.001を使用しました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/67216fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67216/67216fig05.jpg"> 図5:400 μM OH-Kynを添加した後のHsKYNase66-W102H-T333Nの吸光度対時間曲線 (A) 400 μM OH-Kynを添加した後の血清インキュベートHsKYNaseの吸光度対時間曲線。(B)1x PBSインキュベートHsKYNase。(C)血清陰性コントロール。.(D)1x PBSネガティブコントロール(n = 3)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/67216fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67216/67216fig06.jpg"> 図6:HsKYNase66-W102H-T333N活性保持。 この活性は、37°Cで1x PBSとプールされたヒト血清で評価されます。 1x PBSでインキュベートしたHsKYNase66-W102H-T333Nとプールされたヒト血清を24時間にわたって保持した元の活性の割合を決定しました(バー=平均±SD値、n=3)。両側の不対応t検定を使用しました。p &lt; 0.001 です。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/67216fig06large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
補足図1:アデノシンとイノシンの標準曲線。 プロットは0〜200μMについて描かれました.アデノシンまたはイノシンを記載された濃度で1x PBSに添加し、次に260nmでの吸光度を測定しました。(n = 3)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/Supplementary%20Figure%201.pdf" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足図2:OH-Kynの標準曲線。 プロットは0〜400μMについて描かれ、OH-Kynを1x PBSに指摘された濃度で添加し、次いで379nmでの吸光度を測定した。(n = 3)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/Supplementary%20Figure%202.pdf" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足図3:200 μMアデノシンを添加した後、HsADA1の濃度が増加した260 nmでの吸光度対時間曲線。 (A)HsADA1の濃度変化に対する反応曲線。(B)1x PBSコントロール(バー=平均±SD、n = 3)に対する吸光度曲線の線形領域の傾きの倍率変化。両側の不対応t検定を**p &lt; 0.01、****p &lt; 0.0001を使用しました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/Supplementary%20Figure%203.pdf" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足図4:400 μMのOH-Kynを添加した後、遺伝子操作されたHsKYNaseの濃度が増加する379 nmでの吸光度対時間曲線。 (A)さまざまな濃度の人工HsKYNaseの反応曲線。(B)1x PBSコントロール(バー=平均±SD、n = 3)に対する吸光度曲線の線形領域の傾きの倍率変化。両側の不対応t検定が用いられた****p &lt; 0.0001。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/Supplementary%20Figure%204.pdf" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足図5:400 μMのOH-Kyn中の熱不活性化酵素を使用した379 nmでの吸光度対時間曲線。 1x PBS中のOH-Kyn 400 μMに熱不活性化HsKYNase酵素を添加し、379 nmでの吸光度を測定しました。(n = 3)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/Supplementary%20Figure%205.pdf" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

The concept of enzyme stability is typically used to refer to an enzyme's thermostability - its ability to retain structure and activity as temperature ...

determining-the-serum-stability-of-human-adenosine-deaminase-1-enzyme

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

酢酸キナーゼ活性の測定方法について説明する。このアッセイは異なるホスホリルアクセプターで、酢酸を形成する方向に酢酸キナーゼの酵素活性と反応速度を決定するための直接的な反応を利用している。さらに、この方法は、酵素を利用する他のアセチルリン酸塩またはアセチル-...

酵素酢酸キナーゼのアセテート形成活性の直接検出

この資料では、疎水性修飾ナフィオン酵素固定化膜方法と膜内のタンパク質および/または酵素を固定化とその特異的活性をテストするを合成するための手順を説明します。...

酵素の固定化と安定化のための疎水性の塩で修飾ナフィオン

このビデオでは、白血病がん細胞の細胞外環境におけるAMPの消費によって生成されるアデノシンおよび関連プリンの代謝を測定するための定量的逆相高速液体クロマトグラフィー(RP-HPLC)法について説明しています。このプロトコールは、異なる培養条件下で精製された慢性リンパ性白血病(CLL)細胞によって産生される細胞外プリンヌクレオチドおよびヌクレオシドの定量のために開発および検証された、感度、特異性、信頼性、再現性のあるRP-HPLCアッセイについて説明しています。...

細胞外プリン代謝:白血病細胞におけるアデノシン生成と代謝を測定するためのHPLCベースのアッセイ

ラディカルベースの​​生体模倣化学、バイオマーカー開発のために必要な建物のアップライブラリに適用されています。...

ケミカルバイオロジーのフリーラジカル：化学的挙動からバイオマーカー探索·開発へ

PAD4は、ペプチジル-アルギニンのペプチジル-シトルリンへの変換に関与する酵素です。PAD4の調節不全は、多くのヒトの疾患に関与しています。容易でハイスループットに適合する蛍光ベースのPAD4アッセイについて説明します。...

プロ蛍光基質アナログを経由してPAD4活性の蛍光ベースの監視

&gt;jove_content&lt;ここで説明するプロトコールは、異なる条件下で培養された慢性リンパ性白血病(CLL)細胞のプリン代謝を測定するために、逆相高速液体クロマトグラフィー(RP-HPLC)を使用する簡単で再現性のある方法を表しています。...

HPLCベースのアッセイは、ヒト慢性リンパ球性白血病細胞における細胞外ヌクレオチド/ヌクレオシド代謝を監視します

酵素の熱安定性は、等温滴定型熱量計 (ITC) によって容易に測定されます。ほとんどの蛋白質の安定性の試金は現在メジャー タンパク質の変性を使用、酵素活性についての情報を提供しません。ITC...

等温滴定熱量測定による酵素の安定性を測定

ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NADH)結合ATPaseアッセイは、低分子ミオシン阻害剤の半高スループットスクリーニングに適合した。この運動アッセイは、384ウェルマイクロプレートフォーマットで実行され、総反応量はウェルあたりわずか20μLです。プラットフォームは、事実上すべてのADP産生酵素に適用可能でなければなりません。...

低分子阻害剤スクリーニングのためのNADH結合ATPaseアッセイの半高スループット適応

タンパク質の高速光化学酸化は、タンパク質の構造特性を示す新たな手法です。異なる溶媒添加剤およびリガンドは、ヒドロキシルラジカル清掃特性を多様に有している。異なる条件でタンパク質構造を比較するために、反応で生成されたヒドロキシルラジカルのリアルタイム補償が反応条件を正常化するために必要である。...

タンパク質トポグラフィ変化の測定のためのタンパク質の高速光化学酸化におけるリアルタイム補正の実現

本プロトコルは、サンデル・コルトフ反応を用いてヒト肝微量体における化学物質がデヨオジナーゼ1(DIO1)活性に与える影響を信頼性高く評価する比色法を記述しています。このプログラムには、あらかじめ定められた受容基準や統計的パフォーマンス指標が含まれており、OECD試験ガイドラインの組み込みに向けた継続的な取り組みを支援しています。...

サンデル・コルトフ反応を用いたヒト肝微体内のデヨジンダーゼ1活性の比色評価

学ぶ血清中酵素安定性評価法を用いたヒトアデノシンデアミナーゼ1の機能解析。タンパク質工学とがん治療における薬物動態プロファイルの予測に役立つ技術です。

ヒトアデノシンデアミナーゼ1酵素の血清安定性の測定

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