網膜血管系における糖尿病誘発性付着性白血球の定量化

私たちの研究室での研究の焦点は、糖尿病における網膜症の原因とそれをどのように予防できるかを知ることです。いくつかの研究所は、目の小血管における白血球の過剰蓄積である白血球うっ滞が糖尿病を増加させていることを示しています。そして、これは糖尿病における網膜の血管の閉塞と変性に寄与する可能性があります。この技術により、網膜血管系における白血球うっ滞の重症度を視覚化および定量化できます。また、薬を含むさまざまな治療法の有効性を評価したい研究にも使用できます。

[講師]圧力注入器をセットアップするには、0.9%生理食塩水バッグを直列に接続します。静脈内カテーテルセット、四方活栓弁、および強制経口針。灌流システムを開き、ラインとポートを生理食塩水で毎分18〜20ミリリットルの流量で2分間洗い流し、気泡を取り除きます。麻酔をかけたマウスを灌流ステージに仰臥位に置きます。剣状突起を視覚的に識別します。止血剤を利き手に持って、皮膚を固定してロックします。次に、止血剤を利き手ではない手に移し、皮膚を持ち上げます。次に、はさみを使用して、背骨に対して90度の角度で皮膚のパッチを切り、腹壁の外壁を露出させます。剣状突起と胸郭が見える状態で、臓器や主要な血管を慎重に避けながら、腹壁を通して両側を解剖します。次に、横隔膜を通して心室と肺を視覚化します。はさみの先端を使用して、背骨近くの片側の横隔膜を切開します。胸骨を二分した後、胸腔内の心臓を露出させます。利き手ではない手に鉗子を持って、心臓の頂点近くをつかみます。利き手を使用して、静脈内カテーテルに取り付けられた強制経口針を持ち、心臓の頂点に穴を開けます。左心室に完全に穴が開いたり、肺血管系に入ったりしないように、強制口針のボール先端が穿刺部位からわずかに突き出ていることを確認してください。次に、活栓を開いて0.9%の生理食塩水を流します。同時に、はさみを使って右心房を切り開きます。血管系のよじれを防ぎ、心臓からの血液排出を増加させるために、針を左右に上下に穏やかに動かしながら、灌流を2〜3分間続けます。灌流後、活栓ハンドルを回して生理食塩水の流れを遮断し、注射器から強制経口針への流れを許可します。次に、30〜35秒以内に10ミリリットルのコンカナバリンA溶液を手動で灌流します。麻酔をかけたマウスの心臓にコンカナバリンA溶液を灌流した後、マウスを横向きにします。利き手ではない手の人差し指を上まぶたに置き、親指を下まぶたに置きます。まぶたと周囲の皮膚をそっと引っ込めて目を前突させ、眼窩から部分的に膨らませます。次に、利き手の湾曲したハサミを使用して、目の下を45度の角度ですくいます。筋肉の付着物と視神経を切断します。はさみをへらとして使用し、目を小さな容器に移します。歯科用ワックスの上に目を置き、グローブを開く準備をします。解剖顕微鏡下で、マイクロ鉗子を使用して、目の後部に付着した強膜ひだまたは筋肉の残骸を持ち、角膜が片側を向くように目の向きを向けます。輪部の後ろと平行に切開します。マイクロハサミを使用して、アイカップの周囲の水晶体を含む目の前眼部を分離し、網膜が強膜から完全に切り離されていることを確認します。マイクロヘラで強膜から網膜をすくい取ります。網膜が視神経によってまだ付着している場合は、網膜と強膜の間にマイクロハサミを挿入して視神経を切断します。固定されていない網膜をPBSを一滴垂らしたスライドに置きます。網膜に4〜5つの放射状の切り込みを入れ、クローバーの葉のパターンを作成して平らにします。10倍の対物レンズを使用して、100倍の倍率で顕微鏡下で平らに取り付けられた網膜を観察します。網膜血管系の蛍光顕微鏡検査では、糖尿病性網膜は、非糖尿病対照では1〜3個であるのに対し、網膜あたり通常3〜12個の白血球で軽度の白血球うっ滞を示したことが示されました。糖尿病サンプルの軽度のクラスタリングとは対照的に、リポ多糖類に挑戦した炎症モデルでは有意な白血球クラスターが観察されました。