ナチュラルキラー細胞由来の細胞外小胞ベースのがんバイオ医薬品を製造および単離するためのスケーラブルなバイオマニュファクチャリングワークフロー

私たちの研究は、がん細胞を殺すのに自然に効果的な免疫細胞の一種によって生成される小さな小胞に焦点を当てています。これらの小胞は、脳などの一次部位と二次部位の両方で、固形腫瘍の治療に有望な治療の可能性を秘めています。この研究では、バイモーダル樹脂を使用してサイズ排除クロマトグラフィーを介して小胞を分離し、小胞を汚染物質から物理的に分離することで製品の純度を最大化し、さらに静電気力によって樹脂内の汚染物質をトラップします。

このビデオのバイオマニュファクチャリングワークフローの詳細は、臨床的に関連する条件を使用し、コストに対してスケーラブルであるため、高純度の細胞外小胞を効果的に大量に生成します。これにより、学術研究室は、信頼性の高い製造および分離プロセスでそのような治療薬の研究に自信を持ってリソースを投資することができます。私たちは現在、これらの小胞と前臨床モデルの治療可能性を調査し、それらがどのように機能するかについての理解を深めています。

まず、製造元の指示に従って、タンパク質液体クロマトグラフィーシステムの迅速な開始を行います。ドリップ・トゥ・ドリップ方式で接続し、カラム内に空気が入らないようにします。サンプルを収集するために、適切な収集チューブを使用してフラクションコレクターをセットアップします。

分画設定を希望の収集量に変更します。80°Cの冷凍庫から40〜80ミリリットルの事前に調製した細胞外小胞またはEVに富むコンディショニング培地を取り出し、37°Cで迅速に解凍します。サンプルを10, 000Gで摂氏4度で30分間回転させ、上清を新しいチューブに移します。

二本鎖DNAレベルを下げるには、EVに富む馴化培地を5ミリモルの塩化マグネシウムと50単位/ミリリットルのエンドヌクレアーゼで処理します。適度な混合で、サンプルを摂氏37度で2〜4時間インキュベートします。クロマトグラフィーシステムの準備ができたら、EVリッチなコンディショニング培地を60ミリリットルのシリンジにロードし、サンプルラインに接続します。

[手動実行]をクリックしてシステムを起動し、流量をゼロに設定します。ソフトウェアの指示に従って、実行をプリエンプティブに保存します。次に、[開始]をクリックします。

Line Beat Double-Filtered PBSを選択し、毎分2ミリリットルの流速で運転し、溶液がカラムを通過するようにします。吸収剤が安定したら、オートゼロUVを押します。流路を変更して、サンプルをカラムの前の廃液ボトルに導きます。5〜20秒後、サンプルをカラムに向けます。

UV 測定値が約 230 ミリ吸光度単位に達したら、[フラクショネーション] をクリックします。サンプルの注入が完了したら、バッファーシステムをダブルフィルターPBSに切り替えて精製を続行します。UV値が約1, 600ミリ吸光度単位に達したら、再度、分画をクリックします。

分析が停止したら、クロマトグラムをPDFドキュメントとして保存します。限外ろ過装置のすべてのコンポーネントを20〜30ミリリットルの90%エタノールですすいでください。4, 000 G で 5 〜 10 分間回転し、フロースルーを破棄します。

次に、滅菌PBSですすぎを行ってデバイスを平衡化し、前と同様に遠心分離手順を繰り返します。NK-EVの希釈した画分をすべて組み合わせます。無菌性を最大限に高めるには、希釈したNK-EV溶液を0.22μmのシリンジフィルターでろ過し、ダブルフィルターPBSでプレウェットします。

ろ液を滅菌した濃縮装置に集めます。濾液を4, 000 Gで15〜40分間回転させます。遠心後、血清学的ピペットを使用して上部フィルターコンパートメント内で溶液を混合します。

再び、4, 000 Gで10分間回転させます。ろ過装置を反転させ、収集装置に取り付けてNK-EVを回収します。NK-EVを2, 000 Gで2分間回転させ、精製した製品を滅菌チューブに移します。

製造元の指示に従って、ナノ粒子追跡分析システムを開始します。フローセルに気泡がないか観察します。気泡が存在する場合は、フローセルを20%エタノールと二重ろ過水ですすいで除去します。

クリアになったら、レーザーモジュールをナノ粒子追跡分析装置に慎重に再挿入します。ドアを閉じて、[カメラの開始]をクリックします。キャプチャ設定を画面ゲイン 2 とカメラ レベル 14 に変更します。

ヒーターをオンにして、フローセルの温度を安定させます。[Standard Measurement] をクリックして、[SOP] タブでスクリプトを作成し、摂氏 23 度で 30 の流量で 1 分間にわたって 1 つのキャプチャを収集します。パス名にフォルダ名とファイル名を追加して、データを保存します。

精製したNK-EV製品をボルテックスし、ダブルフィルターPBSを使用して希釈液を調製します。希釈したサンプルをボルテックスした後、気泡を含まずに1ミリリットルのアクイジションシリンジにロードします。シリンジを機器のローディングラインに慎重に接続します。

サンプルの半分をゆっくりと押し込み、シリンジに約0.5ミリリットルを残します。パーティクルが画面に表示されたら、カメラに焦点を合わせて各パーティクルの周囲に最大1つのハローを配置し、[ハードウェア]タブで[インフューズ]をクリックし、5秒間のレートを1,000に設定します。次に、レートを30に下げます。

[スクリプトの実行]を押します。設定が正しいことを確認したら、[はい]をクリックし、ソフトウェアのプロンプトに従います。キャプチャが完了したら、ソフトウェアがファイルの処理またはエクスポートを求めたら、[キャンセル]をクリックします。

希釈ごとに5つのキャプチャを記録したら、分析のために5つのキャプチャすべてをインポートします。ファイルをハイライト表示し、[選択したファイルの処理] をクリックします。[プロセス] タブで、解析設定を画面ゲイン 2 と検出しきい値 15 に調整します。

チェックを入れて [OK] をクリックし、分析します。処理後、追加のボックスをクリックせずに「はい」をクリックするか、「エクスポート」をクリックしてファイルをエクスポートします。精製されたNK-EVの粒子サイズは76.30〜174.30ナノメートルの範囲で、平均濃度は10の1.39倍12EV/ミリリットルの累乗でした。

さらに、蛍光光度計の定量では、タンパク質濃度が約300ミリグラム/ミリリットル、二本鎖DNA濃度が225ミリグラム/ミリリットルであることが示されました。ヒトK562白血病細胞のNK-EVによる治療では、EC 50が10の9.33倍で、1ミリリットルあたり9台のEVの累乗で細胞生存率が用量依存的に低下することが示されました。