Name: 細胞外小胞単離のための適切なソーティングの設定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-11T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: 学ぶ細胞外小胞の高純度ソーティング法。間葉系幹細胞由来EVを細胞ソーターで分離し、組織再生研究や細胞フリー治療の臨床応用に向けた品質保持と再現性の確保を実現します。

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<meta charset="utf8"></head><body>脂肪由来細胞外小胞の蛍光に基づく選別

<ol><li>Welsh, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+%28misev2023%29%3A+From+basic+to+advanced+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles (misev2023): From basic to advanced approaches.</a> J Extracell Vesicles. 13 (2), e12404(2024).</li>
<li>Xu, R., Greening, D. W., Zhu, H. J., Takahashi, N., Simpson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicle+isolation+and+characterization%3A+Toward+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicle isolation and characterization: Toward clinical application.</a> J Clin Invest. 126 (4), 1152-1162 (2016).</li>
<li>Dixson, A. C., Dawson, T. R., Di Vizio, D., Weaver, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Context-specific+regulation+of+extracellular+vesicle+biogenesis+and+cargo+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Context-specific regulation of extracellular vesicle biogenesis and cargo selection.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 24 (7), 454-476 (2023).</li>
<li>Witwer, K. W., Wolfram, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+versus+synthetic+nanoparticles+for+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mater%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles versus synthetic nanoparticles for drug delivery.</a> Nat Rev Mater. 6 (2), 103-106 (2021).</li>
<li>Cheng, L., Hill, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutically+harnessing+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Therapeutically harnessing extracellular vesicles.</a> Nat Rev Drug Discov. 21 (5), 379-399 (2022).</li>
<li>Du, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles%3A+A+rising+star+for+therapeutics+and+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles: A rising star for therapeutics and drug delivery.</a> J Nanobiotechnology. 21 (1), 231(2023).</li>
<li>Keshtkar, S., Azarpira, N., Ghahremani, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell-derived+extracellular+vesicles%3A+Novel+frontiers+in+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles: Novel frontiers in regenerative medicine.</a> Stem Cell Res Ther. 9 (1), 63(2018).</li>
<li>Orbay, H., Tobita, M., Mizuno, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+isolated+from+adipose+and+other+tissues%3A+Basic+biological+properties+and+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Int%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells isolated from adipose and other tissues: Basic biological properties and clinical applications.</a> Stem Cells Int. 2012, 461718(2012).</li>
<li>Caplan, A. I., Dennis, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+as+trophic+mediators%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells as trophic mediators.</a> J Cell Biochem. 98 (5), 1076-1084 (2006).</li>
<li>Rani, S., Ryan, A. E., Griffin, M. D., Ritter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell-derived+extracellular+vesicles%3A+Toward+cell-free+therapeutic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles: Toward cell-free therapeutic applications.</a> Mol Ther. 23 (5), 812-823 (2015).</li>
<li>Galipeau, J., Sensébé, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stromal+cells%3A+Clinical+challenges+and+therapeutic+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stromal cells: Clinical challenges and therapeutic opportunities.</a> Cell Stem Cell. 22 (6), 824-833 (2018).</li>
<li>Jia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+extracellular+vesicles+isolation+and+separation%3A+Current+techniques%2C+pending+questions+and+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Small extracellular vesicles isolation and separation: Current techniques, pending questions and clinical applications.</a> Theranostics. 12 (15), 6548-6575 (2022).</li>
<li>Ohnuma, K., Yomo, T., Asashima, M., Kaneko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sorting+of+cells+of+the+same+size%2C+shape%2C+and+cell+cycle+stage+for+a+single+cell+level+assay+without+staining%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Sorting of cells of the same size, shape, and cell cycle stage for a single cell level assay without staining.</a> BMC Cell Biol. 7, 25(2006).</li>
<li>Morales-Kastresana, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-fidelity+detection+and+sorting+of+nanoscale+vesicles+in+viral+disease+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">High-fidelity detection and sorting of nanoscale vesicles in viral disease and cancer.</a> J Extracell Vesicles. 8 (1), 1597603(2019).</li>
<li>Mortati, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+study+of+extracellular+vesicles+migration+in+cartilage-derived+osteoarthritis+samples+using+real-time+quantitative+multimodal+nonlinear+optics+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">In vitro study of extracellular vesicles migration in cartilage-derived osteoarthritis samples using real-time quantitative multimodal nonlinear optics imaging.</a> Pharmaceutics. 12 (8), 734(2020).</li>
<li>Andreu, Z., Yanez-Mo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetraspanins+in+extracellular+vesicle+formation+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tetraspanins in extracellular vesicle formation and function.</a> Front Immunol. 5, 442(2014).</li>
<li>Mildmay-White, A., Khan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+markers+on+adipose-derived+stem+cells%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Cell surface markers on adipose-derived stem cells: A systematic review.</a> Curr Stem Cell Res Ther. 12 (6), 484-492 (2017).</li>
<li>Welsh, J. A., Tang, V. A., Van Der Pol, E., Gorgens, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MIFlowCyt-EV%3A+The+next+chapter+in+the+reporting+and+reliability+of+single+extracellular+vesicle+flow+cytometry+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">MIFlowCyt-EV: The next chapter in the reporting and reliability of single extracellular vesicle flow cytometry experiments.</a> Cytometry A. 99 (4), 365-368 (2021).</li>
<li>Maia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Employing+flow+cytometry+to+extracellular+vesicles+sample+microvolume+analysis+and+quality+control%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Employing flow cytometry to extracellular vesicles sample microvolume analysis and quality control.</a> Front Cell Dev Biol. 8, 593750(2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>5(6)-カルボキシフルオレセインジアセテート&nbsp;N-スクシンイミジルエステル</td><td>メルク</td><td>150347-59-4</td><td></td></tr><tr><td>脂肪間葉系間質間質細胞</td><td>Wepredic, Parc d'affaires, 35760 Saint-Gr&eacute;フランス、ゴワール</td><td>この研究で使用した細胞</td>Alexa 488 抗カベオリンR&<td></td></tr><tr><td></td><td>D Systems</td><td>IC5736G</td><td>フローサイトメトリー抗体</td></tr><tr><td>APC 抗ヒト CD44</td><td>BioLegend</td><td>338805</td><td>フローサイトメトリー抗体</td></tr><tr><td>APC 抗ヒト CD63</td><td>BioLegend</td><td>353007</td><td>フローサイトメトリー抗体</td></tr><tr><td>APC 抗ヒト CD81 (TAPA-1)</td><td>BioLegend</td><td>349509</td><td>フローサイトメトリー抗体</td></tr><tr><td>APC 抗ヒト CD9</td><td>BioLegend</td><td>312107</td><td>フローサイトメトリー抗体</td></tr><tr><td>BC CytoFLEX S</td><td>ベックマン・コールター</td><td></td><td>BC CytoFLEX S 3つのレーザー、青、赤、紫</td></tr>を装備 <tr><td>Flow-Check Pro Fluorospheres</td><td>ベックマン・コールター</td><td>A63493</td><td>MoFLO用蛍光制御ビーズ Astrios EQ</td></tr><tr><td>FlowJo ソフトウェア (バージョン10.8.1)</td> <td>BD</td><td>バージョン10.8.1</td><td>分析ソフトウェア</td></tr><tr><td>IntraSureキット</td><td>BD Biosciences</td><td>641776</td><td>細胞内染色のための固定と透過処理</td></tr><tr><td>Megamix-Plus FSC</td><td>BioCytex</td><td>7802</td><td>FSCポリスチレンビーズ&nbsp;</td></tr><tr><td>MoFLO Astrios EQ</td><td>ベックマン・コールター</td><td></td><td>MoFLO Astrios EQ 4つのレーザーを装備、青、黄-緑、紫、赤</td></tr><tr><td>マウス 抗FLOT1抗体</td><td>BD Transduction Laboratories</td><td>610820</td><td>ウェスタンブロット抗体</td></tr><tr><td>NanoSight NS300</td><td>Malvern</td><td>NS300</td><td></td></tr><tr><td>ウサギ抗カルネキシン抗体</td><td>Origene</td><td>TA336279</td><td>Western Blot 抗体</td></tr><tr><td>Rabbit anti-CD9 and CD81 antibody (ExoAb antibody kit)</td><td>System Biosciences</td><td>EXOAB-KIT-1</td><td>Western Blot antibodies</td></tr><tr><td>Rabbit anti-TSG101 antibody&nbsp;</td><td>メルク</td><td>HPA006161</td><td>ウェスタンブロット抗体</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>メルク</td><td>9036-19-5</td><td></td></tr><tr><td>ウルトラレインボー蛍光粒子</td><td>Spherotech</td><td>URFP-30-2</td><td></td></tr><tr><td>ウルトラセル 100 kDa MWCO</td><td>メルク</td><td>UFC910024</td><td></td></tr><tr><td>VER01 - Verity Shells</td><td>Exometry</td><td></td><td>Organo silica ビーズ 散乱キャリブレーション用</td></tr></tbody></table>

細胞外小胞単離のための適切なソーティングの設定

Setting a Successful Sorting for Extracellular Vesicle Isolation

FSCポリスチレンビーズは、装置のセットアップと選別条件を検証するために選別されています。FSCポリスチレンビーズは、100 nm、300 nm、500 nm、900 nmの範囲の蛍光ビーズの混合物で、FITCチャネルで見ることができます。 図7A は、ソート前の4つのビーズ集団を使用したSSC対数スケールとFITC対数スケールのドットプロットを示しています。100 nm、300 nm、および500 nmの蛍光集団をゲーティングし、選別しました。選別したビーズの純度と濃縮度を、最初の概念実証として分析しました(図7B)。選別後、すべての集団は純粋でした。参照バックグラウンドノイズは、ソートの前後にドットプロットに常に表示されます。
MISEV2018/2023に記載されている要件を満たし、小胞の性質とその純度を実証するために、EVに存在するマーカーと存在しないマーカーを分析する実験が行われました。EVは、CD9、CD63、CD81、CD44などの特定の表面マーカー15に対して陽性である。CD9、CD63、およびCD81は、膜タンパク質のテトラスパニンファミリーに属し、エクソソームを同定するための最も一般的なマーカーである16。CD44は、MSCおよびASCによって高度に発現するマーカーである17。
また、EVは細胞質タンパク質であるカベオリンにも陽性であることが、細胞内フローサイトメトリー実験で示されています。さらに、ウェスタンブロットでは、CD9、CD81、TSG101、Flotillinの陽性とCalnexinの陰性が確認されています(図2)。
次に、CFSEとラベル付けされたASC-EVを、プロトコルで報告されているとおりにソートしました。この選別手順を 4 回繰り返し、サンプルの調製、染色、選別についてまったく同じ条件を維持しました(表 1)。このようにして、プロトコルの再現性が実証されました。
CFSEでソートされたASC-EVの母集団を分析し、その特性がソートによって変化していないことを実証するために、一連の実験が行われました。特に、CD9、CD63、CD81、およびCD44の発現は、選別後も変化しません(図6A)。
もう1つの重要な点は、EVの寸法と、圧力によって誘発される応力によって選別手順後にEVがどのように変化するかに関係しています。ソーティング後の分析は、サンプル量が少ないため実施が困難でしたが、ナノ粒子追跡分析により、2つのASC-EVサンプル(ソーティング前とソーティング後)の分布が同じであることがわかりました(図6B)。最後に、TEMによるEVの分析は、選別後もその形態が大きく変化していないことを示しています(図6C)。
注目すべきは、MIFlowCyt-EVフレームワークガイドライン18で示唆されているように、0.1%Triton X-100サンプル処理でCFSE陽性EVの量の減少が観察され、したがってそれらの水疱起源を裏付けていることです(図8)。
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67232/67232fig07.jpg"> 
図7:FSCポリスチレンビーズの選別。 (A)ソート前のビーズのSSC/FITCドットプロット。選別後の再解析ビーズのSSC/FITCドットプロット:(B)100 nm選別ビーズ、(C)300 nm選別ビーズ、(D)500 nm選別ビーズ。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67232/67232fig07large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67232/67232fig08.jpg"> 
図8:Triton X-100の存在下でのEV膜の劣化。 0.1%の濃度のTriton X-100を室温で15分間サンプルに添加しました。未処理(左)サンプルと処理済みサンプル(右)の3つの独立した実験からの代表的な散布図が報告されています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67232/67232fig08large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>実験</td>
			<td>選別されたEVの数</td>
			<td>CFSE+ で分類されたEVの数</td>
			<td>圧力(psi)</td>
			<td>ノズルmm</td>
			<td>周波数 (Hz)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>74×106</td>
			<td>4.8×106</td>
			<td>35</td>
			<td>70</td>
			<td>66000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>44×106</td>
			<td>7 x 106</td>
			<td>35</td>
			<td>70</td>
			<td>66000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>38×106</td>
			<td>3×106</td>
			<td>35</td>
			<td>70</td>
			<td>66000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>16×106</td>
			<td>2 x 106</td>
			<td>35</td>
			<td>70</td>
			<td>66000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1:選別手順の再現性

Extracellular vesicles (EVs) released by mesenchymal stromal cells (MSCs) contain a set of microRNAs with regenerative and anti-inflammatory roles. ...

setting-a-successful-sorting-for-extracellular-vesicle-isolation

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

Source: DeMarino, C., et al. Purification of High Yield Extracellular Vesicle Preparations Away from Virus. J. Vis. Exp. (2019)The video demonstrates the separation of EVs from virions and other contaminants by density gradient centrifugation, followed by capture and concentration with hydrogel nanoparticles. Washed fractions are then ready for downstream identification of those enriched in EVs.

Separation and Enrichment of Extracellular Vesicles in the Presence of Virions

このビデオでは、新鮮または凍結した組織から細胞外小胞を抽出する技術について説明しています。単離された細胞外小胞は、疾患の病因における重要な役割を明らかにするためのさらなる分析に使用できます。...

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このビデオは、特性評価研究に適した細胞外小胞の亜集団を分離するための密度勾配超遠心分離ベースの精製方法を示しています。...

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