Name: マウス脾臓組織由来エクソソームの単離と特性評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-20T14:10:00.000+00:00
Duration: 5 min 27 s
Description: 学ぶマウス脾臓組織由来エクソソームの単離法。コラゲナーゼI型消化と差遠心分離を用いて高品質エクソソームを取得し、細胞膜の完全性を保持します。心血管疾患研究における免疫応答の理解に有用です。

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サンプルはマウスから採取し、広東医科大学の倫理委員会から倫理的な承認を得ました。このプロトコルで使用される材料、機器、およびソフトウェアの詳細な説明は、 資料の表に記載されています。抽出前の調製の詳細を 図1に示し、Spleen-Exoの抽出と濃縮のプロセスを 図2に示します。
1. 事前準備
<ol>
	<li>高速遠心分離機と超高速遠心分離機を4°Cに予冷し、卓上シェーカーの温度を37°Cに設定します。</li>
	<li>図1A、Bに示すように、細胞培養皿(<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67234/67234eq01.jpg" style="margin: auto;">100 mm)、50 mLの滅菌遠心チューブ、氷、および滅菌細胞ストレーナー(<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67234/67234eq01.jpg" style="margin: auto;">70 μm)を調製します。</li>
	<li>はさみと鉗子を75%アルコールスプレーで滅菌した後、高温滅菌します。これらのツールを 図 1C に示します。</li>
	<li>脾臓組織を氷上の滅菌 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67234/67234eq01.jpg" style="margin: auto;">100mmシャーレに入れ、1x氷漬け滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で表面の血液を洗い流します。脾臓組織を滅菌ガーゼで乾燥させ、乾燥後に秤量します。 注:組織が凍結している場合は、先に進む前に、氷の上で皿で15分間解凍します。</li>
	<li>滅菌転写ピペットを使用して滅菌PBS1 mLをストレーナーに滴下することにより、セルストレーナー(<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67234/67234eq01.jpg" style="margin: auto;">70μm)に保湿します。</li>
	<li>Digestive Buffer(0.1% Type Iコラゲナーゼ)を、ボルテックスミキサーで1x PBSを使用して調製します。 注:脾臓組織100 mgごとに10 mLの消化緩衝液を使用してください。.コラゲナーゼ濃度は、製品の説明書に基づいてこの試験で選択されました。他の組織タイプの場合、研究者は組織の密度と組成に基づいてこれらのパラメータを調整する必要がある場合があります。各組織タイプの最適な条件を決定するために、さまざまな濃度と消化時間での予備実験が推奨されます。</li>
</ol>
2.組織消化
<ol>
	<li>氷上の培養皿(図3A)でハサミで組織を均一な小片に切り刻み(図3A)、滅菌トランスファーピペットを備えた50 mLの遠心チューブに移します。</li>
	<li>上記のように脾臓組織の重量に応じて消化バッファーをチューブに加え(図3B)、次に37°Cの水平シェーカーでチューブを45°の角度で振とうします。 消化の進行状況を監視し、組織の塊が分散し、ほとんどが形を失ったら消化を停止します。消化時間は組織によって異なります。本研究の実験条件下では、消化時間は約30分です。</li>
	<li>消化した混合物を室温(RT)でセルストレーナー(Ф70μm)に移し、繊維状およびより大きな組織破片を除去します。 注:消化後すぐに完全なろ過を行います。</li>
	<li>濾液を新しい50 mL遠心分離チューブに集めます。</li>
</ol>
3. 示差遠心分離法によるエキソソーム単離
<ol>
	<li>濾液を500 x g で4°Cで10分間遠心分離します。 残存細胞、細胞破片、および核を含むペレットは、 図3Cに示すように、遠心分離後に見ることができます。</li>
	<li>上清を新しいチューブに移し、3000 x g で4°Cで20分間遠心分離します。 アポトーシス体とミクロソームを含むペレットは、 図3Dに示すように、遠心分離後に見ることができます。</li>
	<li>上清を新しいチューブに移し、10,000 x g で4°Cで30分間遠心分離します。 微小胞と原形質膜を含むペレットは、 図3Eに示すように、遠心分離後に見ることができます。</li>
	<li>得られた上清を120,000 x g で4°Cで2時間超遠心分離します。 遠心分離後のチューブの底にペレットが見えます( 図3Fを参照)。</li>
	<li>上清を捨て、ペレットをPBSで洗浄し、再度120,000 x g で4°Cで2時間超遠心分離してエクソソームを得ます。遠心分離後のチューブの底にペレットが見えます( 図3Gを参照)。</li>
	<li>単離したエキソソームを滅菌PBS(脾臓あたり200μL)で溶解し、単離したエキソソームを新しい2 mL遠心チューブ(-80°C)に保存します。</li>
</ol>
4. 透過型電子顕微鏡(TEM)によるエクソソーム評価
注:TEMを使用して、抽出されたExoが小胞特性を示したかどうかを判断しました。電子顕微鏡で同定されたExoサンプルは、新鮮なサンプルであるか、4°Cで短時間保存する必要があります。
<ol>
	<li>エキソソーム(2-6 μg/μL)を2%電子顕微鏡(EM)グレードのパラホルムアルデヒドで室温で2時間固定します。</li>
	<li>10 μLのエキソソーム溶液を銅メッシュに置き、室温で10分間インキュベートし、滅菌蒸留水ですすぎ、余分な液体を吸収紙で拭き取ります。</li>
	<li>銅メッシュを2%酢酸ウラニルで1分間染色し、余分な液体を濾紙で拭き取り、白熱灯の下で2分間乾燥させます。</li>
	<li>調製した試料を透過型電子顕微鏡で80kVで観察します。</li>
</ol>
5. エクソソームのサイズ分布と粒子濃度測定
<ol>
	<li>標準ポリスチレンナノ粒子(250 nm)をナノフローサイトメーターにロードします。</li>
	<li>BCAタンパク質アッセイキットを使用して、Exoサンプルのタンパク質濃度を測定します。BCA Protein Assayの結果に従ってExoサンプルをPBSで希釈し(エキソソームを1-10 ng/μLに希釈)、Exoサンプルをナノフローにロードして側方散乱強度(SSI)を測定します。</li>
	<li>標準ポリスチレンナノ粒子中のSSIと粒子濃度の比に従ってExo濃度を計算します。 注:サイズ測定の場合、グラジエントサイズ(68 nm、91 nm、113 nm、155 nm)の標準シリカナノ粒子をナノフローサイトメーターにロードすることにより、標準曲線が生成されます。Exo サンプルの読み込みは、次のようになります。Exoのサイズ分布は、標準治療法に従って計算されました。</li>
</ol>
6. エクソソームタンパク質の溶解とイムノブロットの確認
<ol>
	<li>タンパク質分析のために、100 μLのRadio Immunoprecipitation Assay(RIPA)溶解バッファーをエキソソームペレットに添加します。</li>
	<li>激しく渦を巻き、パラフィルムで覆い、RTで20分間岩を動かし、その後再び渦を巻きます。</li>
	<li>1000 x g で30〜60秒間短時間遠心分離してサンプルを採取し、新しい1.5 mL微量遠心チューブに移し、分析まで-20°C〜-80°Cで保存します。</li>
	<li>イムノブロットでは、サンプルを5倍ローディングバッファーと混合して1倍の濃度を達成し、ゲル電気泳動を調製します。</li>
	<li>全組織ホモジネートコントロールが必要な場合は、上記で詳述したように、プロテアーゼ阻害剤を含む強力な溶解バッファーを使用して組織を溶解します。次に、サンプルを10,000 x g で10分間遠心分離し、残りの細胞外マトリックス、全細胞、または無傷の細胞破片を廃棄します。</li>
	<li>エキソソームまたは組織ホモジネートを含むサンプルバッファーを95°Cで5〜10分間煮沸します。レーンごとに等量のタンパク質を10% SDS-PAGEゲルにロードします。組織ホモジネートの等価タンパク質をコントロールとしてロードします。</li>
	<li>従来の電気泳動バッファーを使用して、80 Vの電圧で約2時間ゲル電気泳動を進めます。ウェスタンブロット分析を実施して、精製したライセート中のExoタンパク質の発現を確認し、フラクション中の相対的なExo存在量を比較します。</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>マウス脾臓由来エクソソーム単離のための精製技術

<ol><li>Meldolesi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+and+Ectosomes+in+Intercellular+Communication%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Exosomes and Ectosomes in Intercellular Communication.</a> Curr Biol. 28 (8), R435-R444 (2018).</li>
<li>Costa-Silva, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+cancer+exosomes+initiate+pre-metastatic+niche+formation+in+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver.</a> Nat Cell Biol. 17 (6), 816-826 (2015).</li>
<li>Crescitelli, R., Lasser, C., Lotvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicle+subpopulations+from+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of extracellular vesicle subpopulations from tissues.</a> Nat Protoc. 16 (3), 1548-1580 (2021).</li>
<li>de Jong, B., Barros, E. R., Hoenderop, J. G. J., Rigalli, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+extracellular+vesicles+as+drug+delivery+systems+and+their+potential+in+precision+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Recent advances in extracellular vesicles as drug delivery systems and their potential in precision medicine.</a> Pharmaceutics. 12 (11), 1006(2020).</li>
<li>Crescitelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subpopulations+of+extracellular+vesicles+from+human+metastatic+melanoma+tissue+identified+by+quantitative+proteomics+after+optimized+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Subpopulations of extracellular vesicles from human metastatic melanoma tissue identified by quantitative proteomics after optimized isolation.</a> J Extracell Vesicles. 9 (1), 1722433(2020).</li>
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<li>Leung, L. L., Riaz, M. K., Qu, X., Chan, J., Meehan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+of+extracellular+vesicles+in+oral+cancer%2C+from+transcriptomics+to+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">Profiling of extracellular vesicles in oral cancer, from transcriptomics to proteomics.</a> Semin Cancer Biol. 74, 3-23 (2021).</li>
<li>Shah, R., Patel, T., Freedman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+extracellular+vesicles+in+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Circulating extracellular vesicles in human disease.</a> N Engl J Med. 379 (10), 958-966 (2018).</li>
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<li>Vella, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rigorous+method+to+enrich+for+exosomes+from+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">A rigorous method to enrich for exosomes from brain tissue.</a> J Extracell Vesicles. 6 (1), 1348885(2017).</li>
<li>Hoshino, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicle+and+particle+biomarkers+define+multiple+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicle and particle biomarkers define multiple human cancers.</a> Cell. 182 (4), 1044-1061.e18 (2020).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yiwei+decoction+promotes+apoptosis+of+gastric+cancer+cells+through+spleen-derived+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Yiwei decoction promotes apoptosis of gastric cancer cells through spleen-derived exosomes.</a> Front Pharmacol. 14, 1144955(2023).</li>
<li>Useckaite, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+profiling+of+paired+human+liver+homogenate+and+tissue-derived+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic profiling of paired human liver homogenate and tissue-derived extracellular vesicles.</a> Proteomics. 24 (11), e2300025(2023).</li>
<li>Hurwitz, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+method+for+enrichment+of+whole+brain-derived+extracellular+vesicles+reveals+insight+into+neurodegenerative+processes+in+a+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">An optimized method for enrichment of whole brain-derived extracellular vesicles reveals insight into neurodegenerative processes in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> J Neurosci Methods. 307, 210-220 (2018).</li>
<li>Lai, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome+processing+and+characterization+approaches+for+research+and+technology+development%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Sci+%28Weinh%29%22%5BJournal%5D)">Exosome processing and characterization approaches for research and technology development.</a> Adv Sci (Weinh). 9 (15), e2103222(2022).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome%3A+A+review+of+its+classification%2C+isolation+techniques%2C+storage%2C+diagnostic+and+targeted+therapy+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Exosome: A review of its classification, isolation techniques, storage, diagnostic and targeted therapy applications.</a> Int J Nanomedicine. 15, 6917-6934 (2020).</li>
<li>Roh, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue-derived+exosomes+alleviate+particulate+matter-induced+inflammatory+response+and+skin+barrier+damage+in+atopic+dermatitis-like+triple-cell+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue-derived exosomes alleviate particulate matter-induced inflammatory response and skin barrier damage in atopic dermatitis-like triple-cell model.</a> PLoS One. 19 (1), e0292050(2024).</li>
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<li>Kurian, T. K., Banik, S., Gopal, D., Chakrabarti, S., Mazumder, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidating+methods+for+isolation+and+quantification+of+exosomes%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Elucidating methods for isolation and quantification of exosomes: A review.</a> Mol Biotechnol. 63 (4), 249-266 (2021).</li>
<li>Menu, E., Vanderkerken, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+in+multiple+myeloma%3A+from+bench+to+bedside%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Exosomes in multiple myeloma: from bench to bedside.</a> Blood. 140 (23), 2429-2442 (2022).</li>
<li>Shen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+lysate%2Ftissue+storage+at+-80+degrees+C+on+subsequently+extracted+EVs+of+epithelial+ovarian+cancer+tissue+origins%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Effects of lysate/tissue storage at -80 degrees C on subsequently extracted EVs of epithelial ovarian cancer tissue origins.</a> iScience. 26 (4), 106521(2023).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>70 & マイクロ;m Cell Strainer</td><td>Biologix Group Co., Ltd.USA</td><td>15-1070</td><td></td></tr><tr><td>抗 CD9 抗体</td><td>Cell Signaling Technology, Inc, Inc (CST), USA</td><td>983275</td><td></td></tr><tr><td>抗 GM130 抗体</td><td>Proteintech Group, Inc.中国&nbsp;</td><td>66662-1-LG</td><td></td></tr><tr><td>抗TSG101抗体</td><td>Abcam Plc、英国</td><td>125011</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養皿</td><td>無錫NESTバイオテクノロジー株式会社、中国</td><td>704001</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離管</td>無<td>錫NESTバイオテクノロジー株式会社、中国</td><td>788211</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼI型</td><td>Sigma-Aldrich株式会社、米国</td><td>C2674</td><td></td></tr><tr><td>デスクトップサーモスタットシェーカー</td><td>上海ブルーパードインスツルメンツ株式会社、中国</td><td>THZ-100</td><td></td></tr><tr><td>電気泳動バッファー</td><td>武漢Servicebio技術有限公司、中国&nbsp;</td><td>G2081-1L</td><td></td></tr><tr><td>強化型BCAタンパク質アッセイキット</td><td>Shanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd., China&nbsp;</td><td>P0010S</td><td></td></tr><tr><td>Flow NanoAnalyzer</td><td>NanoFCM Inc.、中国</td><td>N30E</td><td></td></tr><tr><td>蛍光/化学発光イメージングシステム&nbsp;</td><td>Guangzhou Biolight Biotechnology Co., Ltd., China</td><td>GelView 6000Plus</td><td></td></tr><tr><td>HRP ヤギ抗マウスIgG</td><td>Proteintech Group, Inc.China&nbsp;</td><td>15014</td><td></td></tr><tr><td>HRP ヤギ抗ウサギIgGプロ</td><td>テインテックグループ、中国&nbsp;</td><td>15015</td><td></td></tr><tr><td>マイクロプレートリーダー</td><td>Molecular Devices, USA</td><td>CMax Plus</td><td></td></tr><tr><td>Microscissors</td><td>Shanghai&nbsp;医療&nbsp;機器(グループ)&nbsp;Co., Ltd.,China</td><td>WA1010</td><td></td></tr><tr><td>Microscopic Tweezers</td><td>Shanghai&nbsp;医療&nbsp;機器(グループ)&nbsp;Co., Ltd.,China</td><td>WA3010</td><td></td></tr><tr><td>Multifuge X1R Pro centrifuge</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td>75009750</td><td></td></tr><tr><td>Ophthalmic scissors</td><td>Shanghai&nbsp;医療&nbsp;機器(グループ)&nbsp;Co., Ltd.,China</td><td>Y00030</td><td></td></tr><tr><td>Ophthalmic Tweezers</td><td>Shanghai&nbsp;医療&nbsp;インスツルメンツ(グループ)&nbsp;Co., Ltd., China&nbsp;</td><td>JD1060</td><td></td></tr><tr><td>Optima XPN-100限外ろ過遠心分離機</td><td>ベックマン・コールター、米国</td><td>A94469</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td><td>Beijing Solarbio Science &Technology Co.,Ltd., China</td><td>P1003</td><td></td></tr><tr><td>RIPA lysis buffer (strong, without inhibitors)</td><td>Shanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd., China&nbsp;</td><td>P0013K</td><td></td></tr><tr><td>定規</td><td>デリ&nbsp;製造業&nbsp;会社名、中国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGEサンプルローディングバッファー、5x</td><td>Shanghai Beyotime Biotechnology Co.、Ltd.、中国&nbsp;</td><td>P0015</td><td></td></tr><tr><td>トランスファーピペット</td><td>Biologix Group Co., Ltd.USA</td><td>30-0238A1</td><td></td></tr><tr><td>透過型電子顕微鏡</td><td>日立製作所</td><td>H-7650</td><td></td></tr><tr><td>超遠心チューブ</td><td>ベックマン・コールター アメリカ</td><td>355618</td><td></td></tr><tr><td>Western Transfer Buffer&nbsp;</td><td>Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd., 中国&nbsp;</td><td>G2028-1L</td><td></td></tr></tbody></table>

マウス脾臓組織由来エクソソームの単離と特性評価

Isolation and Characterization of Exosomes Derived from Mouse Spleen Tissues

脾臓由来エクソソームの単離と精製 マウス脾臓組織からエクソソームを単離するために、コラゲナーゼ消化と示差超遠心分離の組み合わせを採用しました(図2)。最初のステップでは、脾臓組織を前処理して表面の血液を除去し、その後、I型コラゲナーゼで消化しました。この酵素処理により、細胞外マトリックス成分の分解が促進され、エクソソームの完全性を維持しながらエクソソームが遊離しました。消化後、一連の遠心分離ステップを使用して、細胞の破片、アポトーシス体、およびより大きな小胞を順次除去し、最終的に上清を120,000 x gで超遠心分離してエキソソームをペレット化しました。その後の単離手順により、図3Gに示すように、脾臓由来のExoが豊富なPBS可溶性ペレットが得られました。
TEM の結果 単離されたエクソソームの形態は、エクソソームの特性評価を研究するためのゴールドスタンダードの方法である透過型電子顕微鏡を用いて調べられました。TEMは、エクソソームの存在の検証、エクソソームの品質の評価、エクソソームの形態の観察によく使用されます。TEM画像(図4A)は、エクソソームの特徴であるカップ状の小胞の存在を明らかにしました。これらの小胞は透明な脂質二重層構造を示し、脾臓組織からのエキソソームの分離が成功したことを確認しました。
Spleen-Exoのサイズ分布 エキソソームのサイズ分布と濃度は、ナノフローサイトメーターを使用して決定しました。結果(図4B)は、単離されたエキソソームの直径が30〜150nmの範囲であり、ピーク濃度が約60nmであることを示しました。単離された粒子の直径は主に50〜80nmで、平均粒子濃度は4.6×109 粒子/mLでした。このサイズ範囲は、以前に報告されたエクソソームの特性と一致しており、単離プロトコルをさらに検証しています。
ウェスタンブロット解析 エキソソームマーカーの存在を確認するために、ウェスタンブロット分析を行いました。エクソソームマーカーTSG101およびCD9はSpleen-Exoサンプルで検出されましたが、ネガティブコントロールとして使用されたゴルジマトリックスタンパク質であるGM130は検出されませんでした(図4C)。これに対し、これらのマーカーのタンパク質はマウスの脾臓組織で発現していました(Spleen-T)。これは、単離されたエキソソームが細胞汚染物質を含まなかったため、高純度であることを示しています。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67234/67234fig01.jpg"> 
図1:供給準備 (A)50 mLの遠心チューブ、培養皿、氷、および手術器具をバイオセーフティキャビネットに入れました。(B)滅菌セルストレーナー(<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67234/67234eq01.jpg" style="margin: auto;">70μm)。(C)滅菌された手術器具。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67234/67234fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67234/67234fig02.jpg"> 
図2:脾臓-Exo分離手順。 脾臓組織を調製し、アイスPBSで小片に切断した後、I型コラゲナーゼによる消化と指示通りの遠心分離を行います。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67234/67234fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67234/67234fig03.jpg"> 
図3:Spleen-Exo分離の代表的な画像 (A)その後の消化に備えた小さな脾臓ブロック。(B)消化緩衝液を含む脾臓組織ブロック。(C)500 x g 遠心分離後のペレット。(D)3,000 x g 遠心分離後のペレット。(E)10,000 x g 遠心分離後のペレット。(F)120,000 x g 遠心分離後のペレット。(G)120,000 x g 遠心分離後のエキソソームペレット。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67234/67234fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67234/67234fig04.jpg"> 
図4:脾臓-Exoの同定 (A)TEMの結果は、孤立した粒子がカップ状の形態を持つ円形または楕円形の膜状小胞であることを示しています。スケールバー = それぞれ 200 nm と 50 nm です。(B)Flow Nano Analyzerによるサイズ分布分析により、Spleen-Exoの直径は主に50 nmから80 nmの範囲であり、平均粒子濃度は4.6 × 109 particles/mLであることが示されました。(C)Spleen-Exoにおけるエキソソーム特異的マーカータンパク質(TSG101およびCD9)の発現を示すウェスタンブロット解析、およびGM130の陰性発現。これらのマーカーは、マウス脾臓から抽出したタンパク質サンプル(Spleen-Tグループ)で検出可能でした。代表的なウェスタンブロット画像を示しました(n = 6組織)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67234/67234fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

Exosomes (Exo) are lipid-bilayer structures secreted by various cells, including those of animals, plants, and prokaryotes. Previous studies have revealed ...

isolation-characterization-exosomes-derived-from-mouse-spleen

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このビデオでは、マウス脾細胞の単細胞懸濁液を準備するためにgentleMACSのDissociatorを使用して自動化された組織の解離のためのシンプルな、時間の節約テクニックを説明します。...

gentleMACS Dissociatorとマウス脾臓からの単細胞懸濁液の調製

本論文では、エクソソームの単離、精製および検出のための方法、ならびにそれらの分子量の分析のためのテクニックを示しています。これらのメソッドは、細胞培養液や体液の両方からエキソソーム分離のための適応であり、分子量の分析を越えても機能的研究に役立ちます。...

RNA含有エキソソームの単離と解析

この記事では、マウスの常駐肺間葉系幹細胞（肺MSC）、それらの拡大、特性評価および免疫調節特性の分析の分離を示しています。...

ヘキストの分離および特性評価低 CD45負マウス肺間葉系幹細胞

エキソソーム中の安定したマイクロRNA（miRNA）はの存在は、バイオマーカーとして、また治療的介入のためのルートとしての潜在的有用性のために、細胞間コミュニケーションの新たなモードとして莫大な利益を生成しました。ここでは、搬送中のmiRNAを識別するために、定量PCRに続いて、血液や文化メディアからエキソソーム浄化を示しています。...

血と文化メディア由来エキソソームの精製およびマイクロRNAプロファイリング

ヒト免疫不全ウイルス(HIV)粒子からエクソソームを分離する勾配手順を説明する技術が説明されています。この手順は、HIV感染者のヒト血漿中のHIV粒子からエキソソームを分離するために使用されました。単離されたエキソソームは、サイトカイン/ケモカイン含有量について分析されました。...

HIV-1陽性個体の血漿からエキソソームの単離

胆汁液は、潜在的に重要なバイオマーカーを含む細胞外小胞/エクソソームの貴重な供給源です。このプロトコルは、miRNAプロファイリングを含むさらなる分析のために、ヒトの胆汁からエキソソームを単離するための堅牢な方法を表しています。...

ヒト胆汁からマイクロRNA含有エキソソームの単離とプロファイリング

ここでは、磁気細胞選別と素朴なマウスにそれに続く養子転送によるマウス脾臓から樹状細胞を分離するためのプロトコルを提案する.高食塩活性化樹状細胞のモデルは、養子の転送とフローサイトメトリーのステップバイ...

分離と養子伝高塩処理樹状細胞の抗原提示

このプロトコルは1)大人マウス腓腹筋からの第一次線維芽細胞の隔離そして文化、また2)西部のしみの分析に先行しているスクロース密度勾配と結合される差動ultrarifjugeation方法を使用してexosomesの浄化そして性格描写を示す。...

骨格筋線維芽細胞からのエクソソームの単離と特性評価

ここでは、初代マウス肝臓正弦波内皮細胞(LSEC)単離のためのプロトコールを概説し、実証する。このプロトコールは、肝臓コラゲナーゼ灌流、低速遠心分離による非実質細胞精製、およびCD146磁気ビーズ選択に基づいている。また、フローサイトメトリーと走査型電子顕微鏡を用いて、これらの単離されたLSECの表現型と特性評価も行っています。...

マウス初代肝臓正弦波内皮細胞の単離と特性評価

この研究は、単離された灌流マウスの脳脈絡叢に対するフローサイトメトリーおよび2つの異なるゲーティング戦略を使用する。このプロトコルは、この脳構造に移入する主要な免疫細胞サブセットを識別します。...

微小解剖マウス脈絡叢からの免疫細胞の単離と特性評価

学ぶマウス脾臓組織由来エクソソームの単離法。コラゲナーゼI型消化と差遠心分離を用いて高品質エクソソームを取得し、細胞膜の完全性を保持します。心血管疾患研究における免疫応答の理解に有用です。

マウス脾臓組織由来エクソソームの単離と特性評価

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