マウス脾臓組織由来エクソソームの単離と特性評価

組織由来エクソソームは、組織の特異性と微小環境を正確に反映する能力があるため、ますます注目されています。私たちの研究は、心血管疾患における脾臓由来エクソソームの基本的および翻訳的役割を理解することに焦点を当てました。本研究では、マウスの脾臓組織からエクソソームを単離するための実用的なプロトコールを開発し、その後の同定解析や機能研究のための再現性のある手法を提供します。

消化にはI型コラゲナーゼを使用し、その後、示差超遠心分離によるろ過により、高品質の脾臓エキソソームを作製します。それとは対照的に、組織の均質化を使用して組織懸濁液を得るという私たちのアプローチは、組織内の細胞の膜の完全性を維持します。この手法は、免疫応答におけるエクソソームの役割を研究するのに特に役立つ可能性があります。

免疫系における脾臓の重要な機能を考えると、将来の研究では、このプロトコルをヒト組織に適応させ、診断および治療目的で臨床的に重要なエクソソームの抽出を可能にする可能性があります。まず、高速遠心分離機と超高速遠心分離機を摂氏4度に予冷し、卓上シェーカーの温度を摂氏37度に設定します。直径100ミリメートルの細胞培養皿を調製します。

次に、直径70マイクロメートルの50ミリリットルの滅菌遠心分離チューブ、氷、および滅菌細胞ストレーナーを配置します。アルコール75%をスプレーしてハサミと鉗子を滅菌し、高温で加熱してさらに滅菌します。次に、脾臓組織を氷上の滅菌済み100mmシャーレに入れ、冷たい1X PBSで表面の血液を洗い流します。

組織を計量する前に、滅菌ガーゼで脾臓を完全に乾かしてください。次に、滅菌トランスファーピペットを使用して、70μmのセルストレーナーにPBSを1ミリリットル加えて湿らせます。最後に、ボルテックスミキサーを用いて1X PBS中の0.1%I型コラゲナーゼを調製し、消化バッファーを得ます。

まず、組織処理用の試薬と滅菌ツールを準備します。ハサミで、氷上の培養皿で脾臓組織を小さく均一な断片に切り刻み、滅菌移送ピペットを使用して50ミリリットルの遠心分離チューブに移します。次に、脾臓組織の重量に基づいて消化バッファーをチューブに加え、摂氏37度に設定された水平シェーカーでチューブを45度の角度で振とうします。

組織の塊が分散し、ほとんどの断片が形を失ったら、消化を停止します。消化した混合物を室温で70μmのセルストレーナーに通し、繊維状で大きな組織の破片を取り除きます。濾液を新しい50ミリリットルの遠心分離チューブに集めます。

濾液を500Gで摂氏4度で10分間遠心分離します。次に、上清を新しいチューブに移し、適切な速度で遠心分離ステップを繰り返します。超遠心分離後、上清を捨て、ペレットをPBSで洗浄します。

エクソソームを単離するために、摂氏4度で2時間120、000 Gで再び超遠心分離します。最後に、単離されたエキソソームを脾臓あたり200マイクロリットルの滅菌PBSに溶解し、摂氏マイナス80度の2ミリリットルの遠心分離チューブに保管します。透過型電子顕微鏡の画像により、エクソソームに特徴的な脂質二重層を持つカップ状の小胞の存在が明らかになりました。

エキソソームのサイズは30〜150ナノメートルの範囲であり、サイズ分布グラフに示すように、ピーク濃度は60ナノメートルでした。ウェスタンブロット解析では、エキソソームマーカーであるTSG101およびCD9の存在が確認されましたが、GM130およびネガティブコントロールは検出されませんでした。