Name: Ex Vivoモデルにおける組織石灰化の包括的な特性評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-27T14:35:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: 学ぶEx Vivoモデルにおける組織石灰化の包括的評価法。マイクロCT、深層学習、ナノインデンテーション、ラマン分光法など多角的アプローチで骨再生の質と構造を解析し、再生医療の治療薬候補の早期同定に貢献する。

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この研究は、倫理および動物福祉委員会およびフランス国立獣医食品局によって番号G44171で承認されています。
1. 骨軟骨外植片の調製と培養
<ol><li>無菌環境で安楽死させたばかりの動物から羊の関節標本を収穫します。羊を仰臥位に置き、左後肢を剃ります。膝関節の周りをアルコールで消毒して準備します。外側傍膝蓋骨切開術を使用して、前十字靭帯と後十字靭帯を露出させ、続いて膝蓋骨脱臼を使用して大腿骨滑車を明らかにします。<ol><li>組織採取後、骨軟骨自家移植システムを使用して、外側顆に直径 4.75 mm の欠損を作成します。</li>
	</ol></li>
	<li>整形外科用ハンマーを使用して、深さ10mmの欠陥を作成し、顆から外植片を回収します。続いて、骨軟骨自家移植システムを使用して、最初の欠陥を中心に直径8mmの2番目の欠陥を行います。これにより、8 mm x 10 mmの骨軟骨外植片が得られ、4.75 mm x 10.0 mmの中央欠損が含まれます。</li>
	<li>物流上の理由から必要な場合は、外植片を1%ペニシリン-ストレプトマイシンを添加したハンク平衡塩溶液(hBSS)で輸送し、4°Cで保存します。</li>
	<li>外植片をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で3回すすぎ、4.75 mm x 10.0 mmの欠損部に40 μg/mLのBMP2を添加したリン酸カルシウムセメントを注入します。以下に説明するようにセメントを準備します。<ol><li>アパティックリン酸三カルシウムロッド(120 MPaの静水圧プレス)を1364°Cで最低12時間熱処理することにより、α-リン酸三カルシウム(α-TCP)を製造し、続いて14を空冷します。</li>
		<li>α-TCPロッドを無水エタノール中で遊星ミルボール2回、500rpmで5分間粉砕し、13.1±1.7μmの微粉末を生成します(前述のように、レーザー回折を使用して測定14)。</li>
		<li>α-TCP粉末を180°Cで45分間乾熱して滅菌します。リン酸カルシウムセメントを、α-TCP粉末を2.5%(w / v)Na2HPO4 0.22μmろ過溶液(液体/粉末比0.35)と1分間混合して調製します。</li>
		<li>18Gの針を使用して注入する前に、セメントペーストを3mLのシリンジに入れます。</li>
	</ol></li>
	<li>室温(RT)で10分後、外植片を25cm²のフラスコに移し、10%のウシ胎児血清と1%ペニシリン-ストレプトマイシンを補給したダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)高グルコースからなる10mLの完全培地を穏やかに加えます。</li>
	<li>外植片を5% CO2 の入った37°Cインキュベーターで最大28日間維持し、層流フードの下で2日ごとに全培地を交換します。</li>
	<li>外植片をPBSで3回すすぎます。それらを50 mLチューブに移し、20 mLの4%パラホルムアルデヒド(PFA)を加え、4°Cで3日間保持します。次に、外植片をPBSですすぎ、70%エタノールで保存してから、その後の分析を行います。</li>
</ol>2. マイクロCT解析
<ol><li>マイクロCTX線を用いたマイクロトモグラフィー解析を行います。10.7 μmの分解能でX線投影を取得し、露光時間は1200 ms、1 mmのアルミニウムフィルター(80 kVおよび125 μA)を使用します。0.45°の回転増分ごとに3つの画像を平均化して、S/N比を向上させます。</li>
	<li>リファレンススキャンによるX/Yアライメント後、メーカーの再構築ソフトウェアを使用して3次元(3D)画像を再構築します。これには、スムージング:0、リングアーティファクト:3、ビーム硬化:35%のパラメータがあります。画像処理ソフトウェアで画像スタックをクリーニングし、2次元(2D)および3D視覚化ツールで観察します。</li>
</ol>3. ディープラーニングによる画像解析
<ol><li>専用の専用ソフトウェアを使用して画像セグメンテーションを行います。統合セグメンテーション ウィザードを使用して、骨とセメントの識別のための深層学習モデルに学習させます。</li>
	<li>再構成されたマイクロCT画像から、骨、セメント、および背景を含む代表的なゾーン(フレーム)を選択します。この最初のフレームは、ソフトウェアが提供する単純なツール(しきい値など)または強力なツール(伝播など)を使用して手動でセグメント化します。</li>
	<li>[モデル] タブでディープ ラーニング モデルを生成し、ドロップダウン メニューで [3D-Unet ルーチン ] を選択します。生成されたモデルを右クリックして分析する画像を使用して、その実験パラメータをadequationで定義します。ここで、深さ5、パッチサイズ32 x 32、Adadetla アルゴリズム、ストライド比 0.25、データ拡張 x10。</li>
	<li>セグメント化されたフレームを使用して、深層学習ルーチンを訓練します(「Train Button」をクリック)が、これは、その高速で正確な画像セグメンテーション機能3,15に関連していると認められています。トレーニングが完了したら、2 番目の作業ゾーン (フレーム) を定義し、predict 関数を使用して自動的にセグメント化します。<ol><li>必要に応じて手動修正を適用して、より正確なトレーニング データを生成します。もう一度ルーチンを訓練します。満足のいく結果が得られるまで、このプロセスを繰り返します。データ拡張の数は、トレーニング フレームの数が増えるにつれて徐々に減少します。 注: モデルのトレーニング中に提供される DICE インデックスは、(入力情報と比較して) モデルの精度を示しますが、十分ではありません。モデルの関連性の確認は、3人の独立した経験豊富な研究者による自動的にセグメント化されたデータの検証によって実行する必要があります。</li>
	</ol></li>
	<li>「Export」ボタンをクリックしてモデルを公開し、「Segment &gt; Exported Model &gt; Segment Full Dataset」をクリックして、マイクロCTデータセット全体に適用します。</li>
</ol>4. 埋め込み
<ol><li>骨外植片を、70%アセトンと30%キシレンで構成される25mLの脱水溶液を含む40mLガラスバイアルに入れて脱水します。.ガラスバイアルを回転ホイールに置き、RTで1時間、この手順を3回繰り返します。</li>
	<li>脱水溶液を25 mLのキシレンと交換し、ガラスバイアルを回転ホイールにRTで1時間置きます。.</li>
	<li>キシレン溶液を、10%過酸化ベンゾイル(BPO)および10%フタル酸ジブチル(DBP)を含む25mLのメタクリル酸メチル(MMA)に置き換えます。.RTで1時間回転ホイールに置き、この手順を2回繰り返します。</li>
	<li><li><li></ol><ol><li><li><li><li><li><li><li></li><li><li></li><li> </li></ol><ol><li></li><li><li><ol><li><li><li><li></ol></li><li><ol><li><li><li><li></ol></li><li><ol><li><li><li><li><li><li></ol></li><li><ol><li><li></ol></li></ol><ol><li><li><li></li><li><li></li><li><ol><li></li><li></li></ol></li><li></li></ol><ol><li><li><li> </li><li><li><ol><li> <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67235/67235eq01.jpg" style="margin: auto;"> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/67235/67235eq02.jpg" style="margin: auto;"> <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/67235/67235eq03.jpg" style="margin: auto;"></li><li> <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/67235/67235eq04.jpg" style="margin: auto;"></li><li> <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/67235/67235eq05.jpg" style="margin: auto;"></li><li></li><li> </li></ol></li></ol>

<meta charset="utf8"></head><body>外植片モデルを用いた骨形成のマルチモーダル解析

<ol><li>Feroz, S., Cathro, P., Ivanovski, S., Muhammad, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomimetic+bone+grafts+and+substitutes%3A+A+review+of+recent+advancements+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Eng+Adv%22%5BJournal%5D)">Biomimetic bone grafts and substitutes: A review of recent advancements and applications.</a> Biomed Eng Adv. 6, 100107(2023).</li>
<li>Tsuji, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP2+activity%2C+although+dispensable+for+bone+formation%2C+is+required+for+the+initiation+of+fracture+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">BMP2 activity, although dispensable for bone formation, is required for the initiation of fracture healing.</a> Nat Genet. 38 (12), 1424-1429 (2006).</li>
<li>Hadjidakis, D. J., Androulakis, I. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Boneremodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Boneremodeling.</a> Ann N Y Acad Sci. 1092, 385-396 (2006).</li>
<li>Boivin, G., Meunier, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+degree+of+mineralization+of+bone+tissue+measured+by+computerized+quantitative+contact+microradiography%5BTitle%5D)+AND+%22Calcified+Tiss+Int%22%5BJournal%5D)">The degree of mineralization of bone tissue measured by computerized quantitative contact microradiography.</a> Calcified Tiss Int. 70 (6), 503-511 (2002).</li>
<li>Boivin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+remodeling+on+the+mineralization+of+bone+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoporo+Int%22%5BJournal%5D)">Influence of remodeling on the mineralization of bone tissue.</a> Osteoporo Int. 20 (6), 1023-1026 (2009).</li>
<li>Zanghellini, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+analysis+and+comparison+of+stoichiometric+and+structural+characteristics+of+parosteal+and+conventional+osteosarcoma+with+massive+sclerosis+in+human+bone%5BTitle%5D)+AND+%22J+Str+Biol%22%5BJournal%5D)">Multimodal analysis and comparison of stoichiometric and structural characteristics of parosteal and conventional osteosarcoma with massive sclerosis in human bone.</a> J Str Biol. 216 (3), 108106(2024).</li>
<li>Trento, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((formation+around+two+titanium+implant+surfaces+placed+in+bone+defects+with+and+without+a+bone+substitute+material%3A+A+histological%2C+histomorphometric%2C+and+micro-computed+tomography+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Implant+Dent+Relat+Res%22%5BJournal%5D)">formation around two titanium implant surfaces placed in bone defects with and without a bone substitute material: A histological, histomorphometric, and micro-computed tomography evaluation.</a> Clin Implant Dent Relat Res. 22 (2), 177-185 (2020).</li>
<li>Palmquist, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multiscale+analytical+approach+to+evaluate+osseointegration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mater+Sci+Mater+Med%22%5BJournal%5D)">A multiscale analytical approach to evaluate osseointegration.</a> J Mater Sci Mater Med. 29 (5), 60(2018).</li>
<li>Budán, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+radiomics+evaluation+of+bone+formation+utilizing+multimodal+%28SPECT%2FX-ray+CT%29+in+vivo+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Novel radiomics evaluation of bone formation utilizing multimodal (SPECT/X-ray CT) in vivo imaging.</a> PLoS ONE. 13 (9), e0204423(2018).</li>
<li>Hulsart-Billström, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+surprisingly+poor+correlation+between+in+vitro+and+in+vivo+testing+of+biomaterials+for+bone+regeneration%3A+results+of+a+multicentre+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Cells+Mater%22%5BJournal%5D)">A surprisingly poor correlation between in vitro and in vivo testing of biomaterials for bone regeneration: results of a multicentre analysis.</a> Eur Cells Mater. 31, 312-322 (2016).</li>
<li>Cramer, E. E. A., Ito, K., Hofmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+bone+models+and+their+potential+in+preclinical+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Osteoporo+Rep%22%5BJournal%5D)">Ex vivo bone models and their potential in preclinical evaluation.</a> Curr Osteoporo Rep. 19 (1), 75-87 (2021).</li>
<li>Chan, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+trabecular+bone+explant+model+of+osteocyte-osteoblast+co-culture+for+bone+mechanobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">A trabecular bone explant model of osteocyte-osteoblast co-culture for bone mechanobiology.</a> Cell Mol Bioeng. 2 (3), 405-415 (2009).</li>
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<li>Paré, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+and+axially+vascularized+calcium+phosphate-based+implants+for+segmental+mandibular+defects%3A+A+promising+proof+of+concept%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Standardized and axially vascularized calcium phosphate-based implants for segmental mandibular defects: A promising proof of concept.</a> Acta Biomater. 154, 626-640 (2022).</li>
<li>Roschger, P., Fratzl, P., Eschberger, J., Klaushofer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+quantitative+backscattered+electron+imaging+for+the+measurement+of+mineral+density+distribution+in+human+bone+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Validation of quantitative backscattered electron imaging for the measurement of mineral density distribution in human bone biopsies.</a> Bone. 23 (4), 319-326 (1998).</li>
<li>Roschger, P., Plenk, H., Klaushofer, K., Eschberger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+scanning+electron+microscopy+approach+to+the+quantification+of+bone+mineral+distribution%3A+backscattered+electron+image+grey-levels+correlated+to+calcium+K+alpha-line+intensities%5BTitle%5D)+AND+%22Scanning+Micro%22%5BJournal%5D)">A new scanning electron microscopy approach to the quantification of bone mineral distribution: backscattered electron image grey-levels correlated to calcium K alpha-line intensities.</a> Scanning Micro. 9 (1), 75-86 (1995).</li>
<li>Porter, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quick+and+inexpensive+paraffin-embedding+method+for+dynamic+bone+formation+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Quick and inexpensive paraffin-embedding method for dynamic bone formation analyses.</a> Sci Rep. 7, 42505(2017).</li>
<li>Goldschlager, T., Abdelkader, A., Kerr, J., Boundy, I., Jenkin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Undecalcified+bone+preparation+for+histology%2C+histomorphometry+and+fluorochrome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Undecalcified bone preparation for histology, histomorphometry and fluorochrome analysis.</a> J Vis Exp. (35), e1707(2010).</li>
<li>Kazanci, M., Roschger, P., Paschalis, E. P., Klaushofer, K., Fratzl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+osteonal+tissues+by+Raman+spectral+mapping%3A+Orientation-composition%5BTitle%5D)+AND+%22J+Str+Biol%22%5BJournal%5D)">Bone osteonal tissues by Raman spectral mapping: Orientation-composition.</a> J Str Biol. 156 (3), 489-496 (2006).</li>
<li>Unal, M., Ahmed, R., Mahadevan-Jansen, A., Nyman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compositional+assessment+of+bone+by+Raman+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Compositional assessment of bone by Raman spectroscopy.</a> Analyst. 146 (24), 7464-7490 (2021).</li>
<li>Oliver, W. C., Pharr, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+technique+for+determining+hardness+and+elastic+modulus+using+load+and+displacement+sensing+indentation+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mater+Res%22%5BJournal%5D)">An improved technique for determining hardness and elastic modulus using load and displacement sensing indentation experiments.</a> J Mater Res. 7 (6), 1564-1583 (1992).</li>
<li>Proffen, B. L., McElfresh, M., Fleming, B. C., Murray, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+anatomical+study+of+the+human+knee+and+six+animal+species%5BTitle%5D)+AND+%22Knee%22%5BJournal%5D)">A comparative anatomical study of the human knee and six animal species.</a> Knee. 19 (4), 493-499 (2012).</li>
<li>Allen, M. J., Houlton, J. E. F., Adams, S. B., Rushton, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+surgical+anatomy+of+the+stifle+joint+in+Sheep%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Surg%22%5BJournal%5D)">The surgical anatomy of the stifle joint in Sheep.</a> Vet Surg. 27 (6), 596-605 (1998).</li>
<li>Kleuskens, M. W. A., van Donkelaar, C. C., Kock, L. M., Janssen, R. P. A., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ex+vivo+human+osteochondral+culture+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ortho+Res%22%5BJournal%5D)">An ex vivo human osteochondral culture model.</a> J Ortho Res. 39 (4), 871-879 (2021).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0.20</td><td>フィルターVWR&nbsp;</td><td>28145-501</td><td></td></tr><tr><td>18 G 針 (1,2x40 mm)</td><td>ステリカン</td><td>4665120</td><td></td></tr><tr><td>3 mL シリンジ</td><td>HENKE-JECT</td><td>8300005762</td><td></td></tr><tr><td>37% 塩酸&nbsp;</td><td>VWR&nbsp;</td><td>1.00317.1000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>酢酸(氷)&nbsp;</td><td>シグマ&nbsp;</td><td>A6283&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>アセトン&nbsp;</td><td>VWR&nbsp;</td><td>20063-365&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>アルシアンブルー8GX</td><td>VWR&nbsp;</td><td></td><td></td>361186</tr><tr><td>水酸化アンモニウム</td><td>VWR&nbsp;</td><td></td><td></td>318612</tr><tr><td>アパタイトリン酸三カルシウム&nbsp;</td><td>Centre for Biomedical and Healthcare Engineering (Mines Saint Etienne, France)</td><td>TV26U&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>アゾフロキシン</td><td>シグマ&nbsp;</td><td></td><td></td>210633</tr><tr><td>過酸化ベンゾイル</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>8.01641.0250</td><td></td></tr><tr><td>BMP2</td><td>メドトロニック&nbsp;</td><td>InductOs 1.5 mg/mL</td><td></td></tr><tr><td>ブリヤントクロセイン&nbsp;</td><td>アルドリッチ&nbsp;</td><td></td><td></td>2107507</tr><tr><td>CTVox&nbsp;</td><td>ブル</td><td>カー-DataViewer</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>スカイスキャン</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>ダイヤモンドブレード</td><td>ストルアス</td><td>MOD13</td><td></td></tr><tr><td>ダイヤモンドソー</td><td>ストルアス</td><td>アキュトム-50</td><td></td></tr><tr><td>ダイヤプロ モル B3 ダイヤモンド溶液</td><td>ストルアス</td><td>40600379</td><td></td></tr><tr><td>ダイヤプロ ナップ B1 ダイヤモンド溶液</td><td>ストルアス</td><td>40600373</td><td></td></tr><tr><td>二塩基性リン酸ナトリウム (Na2HPO4)</td><td>シグマ&nbsp;</td><td></td><td></td>102404598</tr><tr><td>フタル酸ジブチル</td><td>Chimie-Plus Laboratoires</td><td>28656</td><td></td></tr><tr><td>DragonFlyソフトウェア&nbsp;</td><td>ORS</td><td>2022.1.0.1231.&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコのモディファイドイーグルミディアム(DMEM)高グルコース、GlutaMAX(TM)、ピルビン酸</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>31966-021</td><td></td></tr>エ<tr><td>オシンY-サージパス&nbsp;</td><td>シグマ&nbsp;</td><td></td><td></td>1002830105</tr><tr><td>エリスロシンB</td><td>シグマ&nbsp;</td><td></td><td></td>102141057</tr><tr><td>エタノール絶対</td><td>VWR&nbsp;</td><td></td><td></td>20820362</tr><tr><td>ユーキット&nbsp;</td><td>ダッチャー</td><td>6.00.01.0003.06.01.01</td><td></td></tr><tr><td>ファルコン 50 mL</td><td>ザルシュテット</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>塩化第二鉄六水和物 (FeCl3, 6H2O)&nbsp;</td><td>メルク&nbsp;</td><td>1.03943.0250</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清(FBS)&nbsp;</td><td>ユーロビオ</td><td>CVFSVF00</td><td></td></tr><tr><td>フクシン酸</td><td>メルク&nbsp;</td><td>1.05231.0025&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ハンクス平衡塩溶液(HBSS)</td><td>バイオセラ</td><td>MS01NG100J</td><td></td></tr><tr><td>ヘマトキシリン</td><td>シグマ&nbsp;</td><td>86.118.9&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>静水圧プレス</td><td>Nova Suisse</td><td>Pmax 1500 bars</td><td></td></tr><tr><td>レーザー回折顆粒度計</td><td>&nbsp;マルバーン</td><td>マスターサイザー 3000</td><td></td></tr><tr><td>ライトグリーン</td><td>プロラボ&nbsp;</td><td></td><td></td>28947135</tr><tr><td>炭酸リチウム</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>A13149&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MD-Mol研磨布</td><td>ストルアス</td><td>40500077</td><td></td></tr><tr><td>メチルシクロヘキサン</td><td>VWR&nbsp;</td><td>8.06147.1000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>メチルシクロヘキサン&nbsp;</td><td>VWR&nbsp;</td><td>8.06147.1000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>メチルシクロヘキサン&nbsp;</td><td>VWR&nbsp;</td><td>8.06147.1000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>メタクリル酸メチル</td><td>シグマ&nbsp;</td><td>8.00590.2500</td><td></td></tr><tr><td>マイクロCT、マイクロスキャナー&nbsp;</td><td>Bruker</td><td>Skyscan 1272</td><td></td></tr><tr><td>リン酸一塩基性ナトリウム (NAH2PO4)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>71496</td><td></td></tr><tr><td>迫撃砲</td><td>Fritsch&nbsp;</td><td>パルベリセット 6</td><td></td></tr><tr><td>N,N, ジメチルアニリン</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>803060</td><td></td></tr><tr><td>ナノインデンテーションステーション</td> アン<td>トンパール</td><td>NHT2</td><td></td></tr><tr><td>ND-NAP 研磨布</td><td>ストルアス</td><td>40500080</td><td></td></tr><tr><td>OATS 骨軟骨自家移植片転写システムセット、4,75 mm</td><td>Arthrex</td><td>AR-1981-04S</td><td></td></tr><tr><td>OATS 骨軟骨自家移植片転写システムセット、8 mm</td><td>Arthrex</td><td>AR-1981-08S</td><td></td></tr><tr><td>Orange G</td><td>Ral</td><td>M15</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド(PFA)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Peel-a-way 使い捨て埋め込み金型</td><td>Polysciences, Inc</td><td>18646C-1</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン (P/S)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Phosphomolybdic acid&nbsp;</td><td>シグマ&nbsp;</td><td>221856-100 g</td><td></td></tr><tr><td>リンタングステン酸</td><td>アルドリッチ&nbsp;</td><td>12863-5&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>研磨機</td><td>Sturers</td><td>Dap V</td><td></td></tr><tr><td>Poupinel</td><td>MEMMERT</td><td>TV26U&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ラマンマイクロスペクトロメータ</td><td>Renishaw</td><td>InVia Qontor</td><td></td></tr><tr><td>Safran du G&acirc;ティナイス&nbsp;</td><td>ラボノール&nbsp;</td><td></td><td></td>11507737</tr><tr><td>走査型電子顕微鏡</td><td>Carl Zeiss</td><td>Evo LS 10</td><td></td></tr><tr><td>SEM</td><td>Zeiss</td><td>Carl Zeiss Evo LS10</td><td></td></tr><tr><td>SiC 箔/研削紙</td><td>Struers</td><td>40400008 (#320), 40400011 (#1000), 40400122 (#2000), 40400182 (#4000)</td><td></td></tr><tr><td>シルバーペイント</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>12686-15</td><td></td></tr><tr><td>ファラデーカップ、カーボン、アルミニウム、シリコン規格の標準スタブ</td><td>Micro-Analysis Consultants Ltd</td><td>8602</td><td></td></tr><tr><td>T25フラスコ</td><td>コーニング</td><td>430639</td><td></td></tr><tr><td>キシレン</td><td>VWR&nbsp;</td><td>28975.325</td><td></td></tr><tr><td>キシリディンポンソー</td><td>アルドリッチ&nbsp;</td><td>19.976-1&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivoモデルにおける組織石灰化の包括的な特性評価

Comprehensive Characterization of Tissue Mineralization in an Ex Vivo Model

外植片のマイクロCT画像を 図2に示します。手動セグメンテーションでは、グローバル閾値を使用して、中央管に存在するセメントから骨を最適に分離することはできません。海綿骨やセメントの認識を向上させるために、深層学習の活用を提案します。ディープラーニングは、生体材料の特性を認識するのに強力であり、骨とセメントの分離を改善するのに役立ち、セメントと骨の相互作用をより適切に評価することを可能にします。これは、セメントとの界面で形成される骨の量を正確に定量化し、この計算に偽のピクセルを組み込まないようにするために最も重要です。
しかし、単に界面の骨を定量化するだけでは、新しく形成された骨を特徴づけるには不十分です。新しい骨の強度と、この新しいマトリックスの形成につながった細胞メカニズムをよりよく理解するには、骨マトリックスの品質と細胞組成に関するより詳細な研究が必要です。骨マトリックスは、qBEIとラマン顕微分光法の2つの補完的なアプローチを使用して特性評価できます。qBEI イメージの例を 図 3 に示します。qBEIでは、グレースケールでエンコードされた各ピクセルがカルシウム濃度に変換されます。これは、海綿骨のカルシウム含有量の分布を評価し、(i)セメントとの界面で新たに形成された骨の石灰化の程度、および(ii)セメントの存在が海綿骨の石灰化を妨害するかどうかを理解するための前提条件です。qBEIの利点は、より長い取得時間を必要とするラマン顕微分光法とは異なり、非常に短時間で高解像度の画像を取得できることです。Ca平均、Caピーク 、Ca幅 などのqBEIパラメータは、カルシウム分布から導き出し、2つのセメントまたは生体材料間の応答を比較するために使用できます。
一方、qBEIは、生体材料との界面における骨基質の有機相の品質に関する情報を提供しません。有機相の材料特性に関する追加情報は、ラマン顕微分光法から得られます。ラマン顕微分光法は、導電性炭素層を除去するために、迅速な表面研削と琢磨の後、qBEIに使用されたものと同じ試料に対して行われます。ラマン顕微分光法では、各ピクセル位置でスペクトルが取得されます。未処理の生のラマンスペクトルと処理済みのラマンスペクトルの例を 図4に示します。各スペクトルには、分析されたピクセルの組成に関する情報が含まれており、埋め込み樹脂に関連するピーク、この場合はpMMA、鉱物相、ピークv1PO4およびv1CO3、および有機相、ピークPro、Hyp、CML、Amide III、PG、CH2、Penが含まれます。とアミドI。 図 4 の例では、未処理のスペクトルは、~812 cm-1 でのコーティング樹脂の寄与と、近赤外赤色レーザーが使用されていますが、蛍光によるゼロ以外の湾曲したベースラインを示しています。スペクトル処理は、さまざまなラマンパラメータの正確な計算、特にバックグラウンド蛍光の除去を確保するための前提条件です。データを取得する際、ユーザーは正確な位置決めと検出器の飽和の回避の両方を確保して、~960 cm-1 に位置する v1PO4 ピークの存在を確認する必要があります。後処理に続いて、特性振動モードの位置に応じてピーク強度比が計算されます。
しかし、材料組成の変化が生体力学的反応の変化につながったかどうかは疑問です。新たに形成された骨の生体力学に関する情報を収集するために、ラマン顕微分光法に使用したのと同じサンプルでナノインデンテーション研究を体系的に実施しています。組織の機械的情報は、荷重対深さ曲線で表されるナノインデンテーション曲線から得られます(図5)。試験の終了時に深さがゼロに戻らないことは注目に値しますが、これは塑性変形と材料に生じる永久的な損傷を表しています。インデンテーションクリープ率は、深さ対時間曲線から導き出されます。
最後に、組織学的染色を使用して、生体材料に対する組織の応答を細胞レベルで評価します(図6)。提案された組織学的染色により、骨様組織の存在だけでなく、細胞(マクロファージ、多核巨細胞、破骨細胞、骨芽細胞)の同定、および生体材料との界面における線維性カプセルの存在の可能性も判断できます。これは、生体材料の生体適合性を理解するために非常に重要ですが、生体材料が劣化したときの新しい骨の持続性も理解するために重要です。
全体として、マルチメソッドアプローチにより、骨形成、新しく形成された骨の品質、および細胞組成の詳細な研究が可能になります。提案された順番に実施すると、すべての調査を同じサンプルで実施できるため、コストと処理時間が削減されます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67235/67235fig01.jpg"> 図1:グラフィカルアブストラクト。 プロトコルの手順の概要については、こちらを参照してください。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67235/67235fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67235/67235fig02.jpg"> 図2:マイクロCTとディープラーニング解析 (A)マイクロCT画像の3D再構成。(B)骨とセメントのセグメンテーション:手動セグメンテーションとディープラーニングの比較。スケールバー= 5 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67235/67235fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67235/67235fig03.jpg"> 図3:カルシウム含有量を決定するための定量的反射電子イメージング。 (A)走査型電子顕微鏡(SEM)で得られたグレーレベルからなる後方散乱画像を、画像解析ソフトウェアによって(B)骨サンプルのホットスポットを示すカルシウムマップに変換します。(C)カルシウム含有量と骨面積の分布をプロットし、3つの主要なqBEIパラメータ(Camean、Capeak、Ca幅)を計算します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67235/67235fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67235/67235fig04.jpg"> 図4:ラマンスペクトルの例。 (A)スペクトル範囲800〜1800cm-1で得られた未処理の生ラマンスペクトル。スペクトルが0から始まらないため、蛍光バックグラウンドははっきりと見えます。樹脂寄与(pMMA)は、~812 cm-1ではっきりと見えます。(B)処理されたスペクトル。関心のあるさまざまな振動モードの位置は、スペクトル上に示されます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67235/67235fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67235/67235fig05.jpg"> (A) ナノインデンテーションデバイスは、試料ブロックの表面における関心領域の位置を定義するために使用される光学部品で構成され、その後、ブロックはインデンテーション部品の下に平行移動されます。(B) 荷重対時間および深さ対時間は、インデンテーション試験中にプロットされ、(C) 荷重対深さ曲線。この例では、選択した深さは 400 nm に固定されています。最大荷重(Lm)、荷重終了時の深さ(hl)、一時停止期間後の深さ(hm)、除荷セグメントの傾き(S)、および試験の積荷-除荷フェーズ下の面積(Wplast)は、荷重対深さ曲線から導出され、さまざまなナノインデンテーションパラメータの計算に使用されます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67235/67235fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67235/67235fig06.jpg"> 図6:培養28日後にセメントで処理した骨軟骨外植片の組織学的分析 (A)Movat染色は、骨と欠陥を埋めるセメントを含む組織構造を示しています。(B)HES染色は、セメント周囲の組織統合と細胞応答を示しています。スケールバー:2.5mm.(C)(B)の強調表示された領域の拡大率は、セメントと周囲の組織との間の界面を詳細に示しており、細胞がセメントに侵入しているのを観察できます。スケールバー:500μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67235/67235fig06large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

Ex Vivoモデルにおける組織石灰化の包括的な特性評価

The extensive characterization of tissue mineralization in the context of bone regeneration represents a significant challenge, given the numerous ...

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Ex Vivoモデルにおける組織石灰化の包括的な特性評価

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