3D流体チップにおける肺切除術後の内皮グリコカリックスのモデル化 - 血管ベースの臓器オンチップシステムの構築へのアプローチ
2025年9月16日
ここでは、肺切除術を模倣するように設計されたオルガンオンチップ(OOC)システムを構築するためのプロトコルを提示します。このシステムは、グリコカリックス障害と肺切除後の合併症との潜在的な相関関係を調査します。
メンサ研究所は血管研究に焦点を当てており、内皮グリコカリックスと血管疾患におけるその役割を研究するための新しい技術を開発しています。最近の開発には、グリコカリックス研究のためのより高度な in vitro モデルの作成と、内皮グリコカリックスの健康と疾患の修復を標的とする治療戦略の研究が含まれます。実験上の課題には、健康なグリコカリックスを正確に複製できない不完全なin vitroモデルや、困難な定量および測定技術が含まれます。
この分野への現在の貢献により、特にがん転移、損傷したグリコカリックスの再生、および血管表面受容体との相互作用における内皮グリコカリックスの役割に関する現在の理解が広がりました。私たちの方法は、従来の技術と比較して、よりよく発達した生体模倣的な内皮グリコカリックスを発現する臓器チップ血管系を作成するための安価で効果的な方法を提示します。まず、50ミリリットルの遠心分離管でシリコーンエラストマーベース10部を重さを量ります。
シリコーンエラストマーベースを含むチューブに硬化剤を1部ずつ注ぎ、最終容量は30ミリリットルになります。均一な溶液を得るために完全に混合します。次に、よく混合した溶液を型に注ぎ、型を真空チャンバーに入れて、PDMSを30〜60分間、または気泡が残らなくなるまで脱気します。
脱気したPDMSを真空チャンバーから取り出し、室温で48時間硬化させる。硬化したPDMSをPLA金型から抽出します。次に、各細胞培養プレートに両面テープを2枚置きます。
次に、各PDMS血管系をテープの半分の上に独自の細胞培養皿に配置します。マイクロピペットを使用して、PDMS血管系に沿って30マイクロリットルのフィブロネクチンを数滴垂らします。必要に応じてPDMSを傾け、ピペットチップを使用して表面を均一にコーティングします。
30分間のインキュベーション後、PDMSからフィブロネクチン溶液を吸引します。次に、キャビネット内でピースを自然乾燥させます。PDMS血管系の半分の両端に3Dプリントされたプラグを配置し、細胞懸濁液の漏出を防ぎ、1個あたり2つのプラグを使用します。
マイクロピペットを使用して、300マイクロリットルのHLMVEC細胞懸濁液を各PDMSピースに播種し、インキュベートします。次に、半分をキャビネットに戻し、4つのプラグを取り外します。HLMVEC培地を加えてPDMS血管系の半分を沈め、再度6〜10時間インキュベートします。
次に、血管系の半分を含むペトリ皿からHLMVEC培地を吸引します。各 PDMS の半分をポリカーボネート ブロックに配置し、適切な位置合わせを確認します。PDMS血管系の端にシリコーンシーラントを塗布します。
下部PDMSピースの両端にインチの長さのチューブを挿入します。次に、上のPDMSの半分を含む上部のアクリルブロックを下部のアクリルブロックに裏返します。アクリルブロックをボルトで固定し、ネジ付きブロックが底にあることを確認します。
3Dプリントされたプラグを使用して、チューブの自由端を塞ぎます。1つのプラグを取り外し、マイクロピペットを使用して500マイクロリットルのHLMVEC培地を血管系にそっと注入します。傾けて気泡を取り除き、プラグを元に戻します。
組み立てたチップと滅菌部品をバイオセーフティキャビネットに持ち込みます。すべてのチューブを接続し、フローシステムを組み立て、入口チューブがシリンジリザーバーの底に接続され、重力の流れが促進されるようにします。次に、フローシステムをHLMVEC培地で穏やかにプライミングします。
50ミリリットルの血清ピペットを使用します。シリンジリザーバーの上部に30ミリリットルの培地を注入し、蠕動ポンプを低速で作動させてチューブを充填します。各PDMS血管系の半分をPBSで5分間洗浄し、血管切片を完全に浸すのに十分な溶液を加えます。
流体シミュレーションでは、対照モデルと比較して、肺切除術モデルの血管分岐部でのせん断応力が有意に上昇していることが示されました。明視野顕微鏡により、24時間後に毎分93.1ミリリットルの静的条件と流動条件の両方で均一なHLMVEC細胞の付着が確認されました。入口分岐部の蛍光イメージングは、対照モデルと肺切除モデルの両方で、無傷で十分に分布した細胞層を示しました。
2 番目の分岐直後の画像検査では、対照モデルと肺切除モデルの両方で実質的な細胞損失が明らかになりました。細胞は接着したままで、両方のモデルで2番目の分岐の下流の領域で一一な染色を示しました。血管モデルにおける均一なDAPI染色核は、流れへの曝露にもかかわらず合流点が維持されていることを示しました。
初期の対照モデル試験では、システムプライミング中に導入された気泡により、細胞分布が不均一になりました。
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概要
本研究では、肺切除術を模倣したオルガン・オン・チップ（OOC）システムの構築プロトコルを提示します。このシステムは、グリコカリックスの障害と肺切除後の合併症との相関関係を調査するために設計されています。
研究の主要構成要素
科学分野
- 血管研究
- 内皮グリコカリックス
- オルガンオンチップ技術
背景
- Mensah研究室は、血管研究および内皮グリコカリックスに焦点を当てています。
- 現在の課題には、不完全なin vitroモデルや定量化の困難さが含まれます。
- グリコカリックスを理解することは、血管疾患に対処する上で極めて重要です。
- 最近の進展は、グリコカリックス研究のためのin vitroモデルの改善を目的としています。
研究目的
- 血管の健康におけるグリコカリックスの役割を調査すること。
- 肺切除研究のための、より正確なオルガンオンチップモデルを開発すること。
- グリコカリックスの健康を標的とした治療戦略を探索すること。
使用した手法
- 器官チップシステムの構築。
- モデル開発におけるシリコーンエラストマーの使用。
- グリコカリックス損傷の調査。
- モデルの有効性に関する実験的検証。
主要な結果
- 開発されたOOCシステムは、肺切除術を効果的に模倣します。
- 得られた知見は、グリコカリックスの損傷と術後合併症との間に相関関係があることを示唆しています。
- 本モデルは、従来の手法と比較して、グリコカリックスの再現性が向上していることを実証しています。
- 得られた知見は、将来的な治療アプローチに寄与する可能性があります。
結論
- 器官チップシステムは、血管反応を研究するための有用なツールです。
- グリコカリックスのダイナミクスを理解することで、治療戦略を向上させることができます。
- 本研究は、血管疾患の理解というより広い分野に寄与するものです。
よくある質問
産業における重要性
3D流体チップを用いた肺切除後の血管内皮グリコカリックスのモデル化は、血管機能に対する剪断応力の影響を精密に検証することを可能にし、血管生物学における重要な課題を解決します。このオルガンオンチップシステムは、外科的介入後の血管合併症に関する初期段階のターゲット検証およびメカニズム的なリスク低減において、予測の信頼性を向上させます。このアプローチは、コンピューターモデリングから実験的検証までのトランスレーショナルな連続性をサポートし、血管および肺領域の研究開発におけるリスク調整後のポートフォリオ決定に寄与します。
バイオ医薬品R&Dにおける戦略的応用
初期発見およびターゲットバリデーション
- せん断応力の変化に対する血管内皮グリコカリックスの応答について、メカニズム的な解析を可能にする。
- 肺切除後の血管経路の応答を明確にすることで、生物学的なリスク低減を支援する。
- 血管修復および合併症軽減戦略のための、機能的なターゲットバリデーションを促進する。
- 後続のトランスレーショナル研究における予測の信頼性を向上させる。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 内皮細胞の応答を再現性高くin vitroでスクリーニングするための、検証済み3D血管システムを提供します。
- 制御された血流条件下でグリコカリックスの状態を定量化するためのアッセイ条件を標準化します。
- 血管の完全性を標的とした化合物評価に向けた、拡張可能なプラットフォームの再利用を可能にします。
- 堅牢なアッセイ開発のための定量的なおよび定性的なアウトプットを提供します。
トランスレーショナル・前臨床研究
- in vitroでの知見を疾患関連の血管モデルと整合させ、トランスレーショナルなバイオマーカー探索を可能にします。
- 計算シミュレーションから血管介入の前臨床検証までの連続性をサポートします。
- 血管標的治療薬における、リスク調整後の進展決定に情報を提供します。
- 術後の血管合併症に対するメカニズムに基づいたリスク低減を提供します。
パイプラインおよびワークフローの統合
この器官チップ（organ-on-chip）法は、初期探索からリード化合物の同定、さらには前臨床研究までを統合し、血管生物学における計算機モデリングと実験的検証を橋渡しするものです。
- 探索生物学：せん断応力が内皮グリコカリックスおよび血管機能に及ぼす影響の仮説検証を可能にします。
- スクリーニング：アッセイの標準化および化合物スクリーニングのための、再現性のある定量的なリードアウトを提供します。
- 分析：免疫染色およびイメージング出力を提供し、異なる実験条件下でのGCXの健康状態を比較します。
- トランスレーショナルリサーチ：in vitroでの血管応答を、前臨床モデルにおける術後合併症のリスクに関連付けます。
- エンタープライズ再利用：多様な血管研究アプリケーションに利用可能な、再利用可能なorgan-on-chipプラットフォームを構築します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：血管標的の検証における予測の信頼性を向上させ、メカニズムの曖昧さを軽減します。
- 運用の価値：血管アッセイの標準化、再現性、および拡張性を高めます。
- 戦略的価値：血管系R&Dパイプラインにおけるより適切なgo/no-go判断と資本効率を支援します。
- ポートフォリオへの影響：血管および肺疾患治療候補薬のリスク調整済み優先順位付けを可能にします。
実施上の検討事項
- 血管生物学、マイクロフルイディクス、および計算モデリングの専門知識が必要です。
- 3Dプリンティング、PDMSモールディング、および高度なイメージング基盤へのアクセスが必要です。
- アッセイの再現性とデータの比較可能性を確保するため、チーム間での標準化が求められます。
- プロトコルの最適化により、さまざまな血管モデルシステムに適応可能です。
- グリコカリックスの健全性の定量化は、現在のイメージングおよび染色技術によって制限される可能性があります。
