Name: 1分子磁気ピンセットを用いたテロメアタンパク質-DNA相互作用の解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-30T14:20:00.000+00:00
Duration: 11 min 21 s
Description: 学ぶ 1分子磁気ピンセットを用いたテロメアタンパク質-DNA相互作用の解析法。TRF2タンパク質の発現・精製、テロメアDNAの調製、力学的アッセイの設定とデータ解析の詳細手順を解説します。

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<meta charset="utf8"></head><body>1分子アッセイを用いたテロメアDNAとのTRF1/2相互作用の研究

<table><tbody><tr><td>抗ジゴキシゲニン</td><td>ロシュ</td><td>11214667001</td><td></td></tr><tr><td>BfaI</td><td>New England Biolab (NEB)</td><td>R0568S</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V900933</td><td></td></tr><tr><td>CMOS カメラ&nbsp;</td><td>Mikrotron</td><td>MC1362</td><td></td></tr><tr><td>CviAII</td><td>New England Biolab (NEB)</td><td>R0640S</td><td></td></tr><tr><td>DIG-11-dUTP</td><td>Jena Bioscience</td><td>NU-803-DIGXL</td><td></td></tr><tr><td>DNA 抽出ソリューション</td><td>G-CLONE</td><td>EX0108</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I, Rnase-Free, Hc Ea</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EN0523</td><td></td></tr><tr><td>dNTP mixture</td><td>Nanjing Vazyme Biotech Co., Ltd (Vazyme)</td><td>P032-02</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Solarbio</td><td>D1070</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads M-270&nbsp; ビーズ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>65305</td><td>ストレプトアビジンビーズ</td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne ビーズ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>65001</td><td>ストレプトアビジンビーズ</td></tr><tr><td>エタノール</td><td>天津 No.6 化学試薬工場</td><td>1083</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>北京 Hwrkchemical共。Ltd</td><td>SMG66258-1</td><td></td></tr><tr><td>イミダゾール</td><td>Solarbio</td><td>II0070</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Solarbio</td><td>I8070</td><td></td></tr><tr><td>イソプロパノール</td><td>天津 No.6 化学試薬工場</td><td>A1079</td><td></td></tr><tr><td>カナマイシン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>EN0523</td><td></td></tr><tr><td>クレノウフラグメント (3&prime;-5&prime; exo-)</td><td>ニューイングランドバイオラボ (NEB)</td><td>M0212S</td><td></td></tr><tr><td></td><td>LabView National Instruments</td><td>https://www.ni.com/en-us/shop/product/labview.html</td><td>グラフィカルプログラミングソフトウェア&nbsp;</td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Bide Pharmatech Co., Ltd (bidepharm)</td><td>BD136449</td><td></td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Solarbio</td><td>L8120-5</td><td></td></tr><tr><td>MseI</td><td>New England Biolab (NEB)</td><td>R0525S</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Shanghai Aladdin</td><td>C111533</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Spectrophotometer</td></tr><tr><td>NdeI</td><td>New England Biolab (NEB)</td><td>R0111S</td><td></td></tr><tr><td>Ni NTAビーズ6FF</td><td>常州Smart-Lifesciences Biotechnology Co.,Ltd</td><td>SA005025</td><td></td></tr><tr><td>ニトロセルロース膜</td><td>ABclonal RM02801</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Solarbio</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Beyotime Biotech Inc (beyotime)</td><td>ST535-500mg</td><td></td></tr><tr><td>rCutSmart Buffer</td><td>New England Biolab (NEB)</td><td>B6004S</td><td></td></tr><tr><td>Rnase A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R4875</td><td></td></tr><tr><td>酢酸ナトリウム</td><td>SERVA Electrophoresis GmbH</td><td>2124902</td><td></td></tr><tr><td>Sumo protease</td><td>Beyotime Biotech Inc (beyotime)</td><td>P2312M</td><td></td></tr></tbody></table>

1分子磁気ピンセットを用いたテロメアタンパク質-dna相互作用の解析

Analyzing Telomeric Protein-DNA Interactions Using Single-Molecule Magnetic Tweezers

図1Aは、原核細胞で発現可能な439アミノ酸と542アミノ酸からなるTRF1とTRF2の概略的なドメインと構造を示しています。TRF1の調製は、文献41に以前に記載されている。ここでは、TRF2の調製の包括的な説明と代表的な結果を提供します。図1Bは、大腸菌でTRF2を発現するために使用されるプラスミドマップを示しています。図1Bに示すように、大腸菌の誘導前後のTRF2発現を評価しました。精製およびタグ切断プロセスもSDS-PAGEを使用して分析しました(図1C)。このプロトコルに従って、両方のテロメア結合タンパク質、TRF1およびTRF2が大腸菌で首尾よく発現した。
テロメアDNAは、末端制限フラグメント(TRF)の形で、4つの制限酵素の組み合わせを使用してヒトゲノムから生成されます。図2Aに示すフローチャートに従って、ヒト細胞からゲノムを抽出しました。この酵素は、完全長テロメアDNAをそのまま残し、ゲノムDNAを選択的に消化するため、1分子アッセイの材料となります。私たちは、さまざまなヒト細胞株を使用してTRF DNA調製物を広範囲に試験してきました。図2Bに示すように、ゲノムDNAの完全性をアガロースゲル電気泳動を用いて調べました。その後、TRFは、テロメア反復配列TTAGGG(図2C)に相補的な蛍光標識オリゴヌクレオチドを用いて、サザンブロッティングにより分析した。これは、他の場所で説明した方法に従って41,56。平均して、人間のTRFの長さは約数キロベースです。
1分子アッセイは、 図3Aに示すように組み立てられたフローセル内で行われます。ニトロセルロースコーティングが負に帯電したガラス表面を覆い、抗体吸着のための親水性マトリックスを提供します。BSA不動態化は、抗ジゴキシゲニン抗体に結合していないニトロセルロースマトリックスの領域をブロックします。鉄ナノ粒子を含まないポリスチレンビーズは、参照ビーズとして機能します。TRFテザーは、ニトロセルロースマトリックス上のジゴキシゲニン抗体と磁気ビーズ表面上のビオチン-ストレプトアビジンとの間の親和性相互作用によって形成されます(図3B)。TRF1またはTRF2はフローセルに導入され、自由拡散を介してTRF DNAテザーに結合します。磁気ピンセットは磁場を調節するために使用され、磁気ビーズに力を発生させてTRFテザーを伸ばしたり緩めたりすることで、タンパク質-DNA相互作用の探索を可能にします。
単一分子の機械的アッセイは、磁気ピンセットのモーターの動きを制御するスクリプトを開発することによって設計されています。フローチャートは、磁気ピンセットを使用した単一分子アッセイのためにMatLabでこのスクリプトを作成するための構造化されたアプローチを提供します(図4A)。磁石はZ軸に沿って0〜25mmの範囲で移動します。力は、磁石の位置に基づいて、磁石の形状に従って、文献54に記載されている方程式を使用して計算されます。特定の力負荷率に対して、磁石の位置と移動速度は、フォースランプアッセイの例(図4B-D)で示されているように、所望の力操作プロファイルを達成するためにMatLabで設計およびプログラムされます。
TRF1を例にとり、1分子磁気ピンセットを用いてテロメアのDNA-タンパク質相互作用を調べました。実験セットアップは、 図5Aに示すように、フォースランプアッセイとして構成でき、フォース-伸長曲線は、タンパク質-DNA相互作用の切断による伸張中にジグザグの特徴を示し、緩和中のトレースは、タンパク質媒介ループのないDNAファイバーを反映します。このセットアップは、 図5B、Cに示すように、フォースジャンプアッセイとして構成することもでき、特定の力の下でのタンパク質-DNA相互作用の伸長と持続時間を測定することができます。テロメアDNA-タンパク質複合体の解離速度論は、これらの測定から導き出すことができます(図5D)。さらに、DNA-タンパク質複合体におけるループの形成は、伸長の変化によって明らかにすることができます(図5E)。さらに、このテロメアDNA実験装置内でタンパク質濃度を滴定することができます。また、ヒト細胞由来のテロメアDNAの長さの不均一性により、様々な長さのテロメアにおけるループ形成メカニズムを調べることができます(図6)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67251/67251fig01v2.jpg"> 図1:TRF1/2の発現と精製 (A)TRF1とTRF2のドメインアーキテクチャ。(B) 大腸菌でTRF2を発現するためのpET28a-SUMO-TRF2のプラスミドマップ。(C)発現および精製のさまざまな段階で得られたサンプルのSDS-PAGE分析。レーン1:IPTGによる誘発なし。レーン2:細胞溶解によって得られたIPTG誘導沈殿物。レーン3:細胞溶解後に得られたIPTG誘導上清。レーン4:Niカラムを流れます。レーン5:低イミダゾールバッファーで洗浄し、不純物タンパク質を除去します。レーン6:300 mMのイミダゾールを含むバッファーを使用した6xHis-SUMO-TRF2の溶出。レーン7:SUMOプロテアーゼ酵素によるSUMOタグの消化。レーン8:Niカラムによる再精製と、20 mMイミダゾールを含むバッファーによるTRF2の溶出(6xHisおよびSUMOタグ除去)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67251/67251fig01largev2.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67251/67251fig02.jpg"> 図2:末端制限フラグメント(TRF)の調製(A)ヒト細胞からのTRF調製のためのフローチャート。(B)5つのヒト細胞株に対する1%アガロースゲルを使用したゲノムDNAの完全性の検討。(C)5つのヒト細胞株についてサザンブロッティングによって行われたTRF分析。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67251/67251fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67251/67251fig03.jpg"> 図3:単一分子メカニカルアッセイの調製(A)単一分子メカニカルアッセイ用のフローセルの調製を示すフローチャート。(B)磁気ピンセットを使用した単一分子メカニカルアッセイの概略図。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67251/67251fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67251/67251fig04.jpg"> 図4:単一分子メカニカルアッセイの設計(A)フォースランプアッセイを実行するためのスクリプトを生成するためのフローチャート。(B)z軸に沿った磁石の移動プロファイル。(C)磁石の動きに対応する力プロファイル。(D)磁石の位置と結果として生じる力との間の相関関係。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67251/67251fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67251/67251fig05.jpg"> 図5:テロメアDNA-タンパク質相互作用を1分子磁気ピンセットでプローブ (A)TRF1-テロメア相互作用を、20 mM HEPES(pH 7.5)、1 mM EDTA、および100 mM NaClを23°Cで含むバッファー中のフォースランプアッセイ(N = 10)でプローブした。 TRF1の濃度は10nMで、力負荷率は±1pN / sでした。適用されたフォースプロトコルは、Frest = 0 pN、Ftest = 2 pN - 8 pN、Fhigh = 10 pN、および Fmax = 20 pN でした。緩衝条件と温度条件は(A)と同じでした。(C)TRF1-テロメア相互作用は、TRF1濃度が10nMのフォースジャンプアッセイでプローブされました。(D)TRF1-テロメア複合体の解離速度論。テストされた力での解離率の対数(平均 ± SD、n = 206)は、Kramer-Bell-Evans モデル(赤の曲線と凡例の方程式)に従います。挿入図は、Ftest での平均解離時間 (&lt;τ&gt;) を示しています。(E)TRF1-テロメア複合体の破裂イベント時の伸長変化(ΔL)の分布。黒と赤の曲線はガウス近似を表します。この図は、Li et al.41の許可を得て修正されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67251/67251fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67251/67251fig06.jpg"> 図6:テロメアでTRF1によって形成されるDNAループの数とサイズ。 (A)[TRF1]=20nMにおけるDNAループサイズ(ΔL)のテロメア長依存性。曲線はガウス近似を表します。(B)[TRF1]=40nMにおけるΔLのテロメア長依存性。(C)ΔLとテロメアあたりの破裂イベントの数Nとの相関。ゼロ次相関は r = -0.20 で、p &lt; 0.001 (サンプル サイズ = 1496) です。(D)ΔLとNの間の負の相関を説明する可能なメカニズムを示す漫画で、TRF1がプライマリループドメインを持つ単一のテロメアを高次トポロジーに圧縮できることを示唆しています。この図は、Li et al.41の許可を得て修正されています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67251/67251fig06large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル1:スクリプトを生成するためのMatLabコード.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67251/JoVE67251-coding%20files-MatLab%20code%20for%20generating%20scripts.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル2:一定の力assay.txtのスクリプト。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67251/JoVE67251-coding%20files-Script%20for%20constant%20force%20assay.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル3:フォースランプassay.txtのスクリプト。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67251/JoVE67251-coding%20files-Script%20for%20force%20ramp%20assay.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足表1:レシピこの<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67251/Supplementary%20Table%201.zip" target="_blank">ファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

1分子磁気ピンセットを用いたテロメアタンパク質-DNA相互作用の解析

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