遺伝子改変Tet-OnスパイキングHEK細胞におけるエレクトロポレーション誘発性活動電位生成の変化のモニタリング

エレクトロポレーションは、高電圧の電気パルスによって細胞膜の透過性を一時的に増加させます。エレクトロポレーションに基づく、筋肉や神経細胞を標的とする臨床治療法は、急速に開発されています。したがって、エレクトロポレーションがこれらの興奮性細胞の活動電位をトリガーする能力にどのように影響するかを調査することが重要です。

インビトロ実験は、エレクトロポレーションが興奮性細胞に及ぼす影響を理解するために非常に重要です。しかし、初代筋細胞とニューロンは非常に複雑なイオンチャネル発現プロファイルを持っているため、興奮とエレクトロポレーションの相互作用を解きほぐすことは非常に困難です。私たちは、tet-onスパイクHEK細胞を使用して、エレクトロポレーションによる活動電位生成の変化をモニターするプロトコルを開発しました。

これらの細胞は、興奮性にするナトリウムチャネルとカリウムチャネルの最小補体を発現します。したがって、このセルは、得られた結果の実験と理論的分析を簡素化しました。私たちのプロトコルを使用すると、非常に穏やかなエレクトロポレーションがすでに細胞の受容性に劇的な影響を与えることができることがわかりました。

これらの結果は、エレクトロポレーションと細胞受容性の理論モデルを開発する道を開き、心臓、脳、骨格筋で急速に出現しているエレクトロポレーションベースの治療法をコミュニティが改善するのに役立ちます。まず、1ミリリットルのPBSを2ウェルカバーガラスチャンバースライドの1ウェルにピペットで入れます。10マイクロリットルの滅菌済み、1ミリグラム/ミリグラムのポリ-L-リジン溶液を加え、ピペットでよく混ぜます。

無菌条件下で室温で1.5時間インキュベートし、層流フード内で、その後、PBSをポリ-L-リジンで除去し、さらに洗浄せずに取り除きます。細胞を播種するには、1.5ミリリットルのチューブ内の培養培地で1〜10希釈のドキシサイクリンストック溶液を調製します。次に、T-25フラスコから培地を取り出します。

二酸化炭素インキュベーター内の2.5ミリリットルのトリプシンEDTA溶液で細胞をトリプシン化し、摂氏37度で2分間加熱します。2.5ミリリットルの新鮮な培地を加え、細胞を静かにピペットで動かして表面から細胞をはがします。培養を確立するために必要なトリプシン処理細胞懸濁液の量を計算します。

以前に計算した細胞懸濁液容量を1, 470マイクロリットルから差し引いて、培地の容量を計算します。興奮性S HEK細胞を含むサンプルを調製するには、計算した量の培地とトリプシン処理した細胞懸濁液を1つのウェルにピペットで移します。ドキシサイクリン希釈液を30マイクロリットル加えます。

チャンバーを二酸化炭素インキュベーターに入れる直前に、ピペットで優しくピペットでよく混ぜます。非興奮性NS HEK細胞を含むサンプルを調製するには、計算容量の培地をウェルにピペットで移し、ドキシサイクリンを含まないS HEK細胞については、計算容量の90%の細胞懸濁液を添加します。実験の2〜3日前に、5%二酸化炭素インキュベーターで摂氏37度のチャンバーをインキュベートします。

実験の前に、3マイクロリットルの電位差染料ストック溶液を1.5ミリリットルのチューブにピペットで入れます。開いたチューブを室温で層流フードに約15分間放置してエタノールを蒸発させ、電位差染料を乾燥させた後、997マイクロリットルの冷温培地を摂氏4度でチューブに追加して、染料を最終濃度12マイクロモルまで溶解します。次に、培地をウェルから取り出します。

1ミリリットルの電位差測定色素溶液を細胞に加えます。細胞を摂氏4度で冷蔵し、20分間インキュベートします。その後、電位差測定色素溶液を取り出してチューブに保存し、1日に最大6回の連続実験で再利用できます。

細胞をチロード溶液で3回やさしく洗浄します。最後の洗浄後、1ミリリットルの低カリウムチロード溶液をウェルにピペットで入れます。まず、エレクトロポレーション用のHEKセルを調製し、パルス発生器をトリガーする顕微鏡システムからのTTL信号を使用して、パルス送達と画像取得の同期を設定します。

チャンバーの底部に、直径0.8ミリメートル、内側の端と内側の端の間に5ミリメートルの距離を持つ2つの平行なプラチナ-イリジウムワイヤー電極を配置します。チャンバーを顕微鏡で固定し、電極をパルス発生器に接続します。電圧プローブと電流プローブを使用して、パルス発生器の出力をオシロスコープに接続し、実験中に正しいパルス供給を検証できるようにします。

細胞を明視野に焦点を合わせ、電極間の中央に位置する細胞を画像化します。タイムラプスモードで80枚の画像を毎秒25フレーム以上の速度で取得します。励起波長635ナノメートルで細胞を照射し、露光時間を10ミリ秒に設定し、約700ナノメートルで発光を検出します。

取得後、2 分間待ちます。パルス発生器インターフェースの電圧を63ボルトに調整します。2分ごとに同じ方法でタイムラプスを記録します。

これらの取得中は、10 番目の画像の取得時に 100 マイクロ秒のパルスを 1 回印加します。パルス電圧が63、75、88、100、125、150、175、200ボルトの画像を集録します。セルがさらされる電界を、印加電圧と電極の距離比として推定します。

データ解析の場合は、タイムラプス録画をTIFF形式にエクスポートし、個々の実験から印加された電圧のすべてのタイムラプス録画を1つのフォルダに配置します。各タイムラプス記録の名前を変更して、MATLAB が電界を認識できるようにします。パルスが適用されない実験開始時の取得については、000Vcmというフレーズを使用して名前を変更します。

次に、GitHubからダウンロードしたアプリケーションを開きます。「データフォルダの選択」をクリックして、1つの実験のタイムラプス録画を含むフォルダを選択します。ピクセルを選択するには、2 つのスライダーを使用して、メンブレンの鮮明な画像を得るための下限しきい値と、分析から破片を排除するための上限しきい値を決定します。

次に、[データの分析]をクリックします。「Analysis」タブに、抽出されたパラメータのテーブルが表示されます。表の右側には、使用された各電場の経時的な相対蛍光のグラフが表示されます。

テーブルの上の左側にあるドロップダウンメニューから、特定の電界のグラフを選択します。すべてのグラフを調べ、偽ピーク検出の場合は手動補正を実行します。「Analysis」タブの下部にある「Clear AUTO peaks」を選択して、自動的に検出されたピークをクリアします。

グラフをクリックして、新しいピークタイムポイントを手動で決定します。必要に応じて、Analysis(分析)タブの下部にあるRerun AUTO peak detection(自動ピーク検出を再実行)を選択し、再度自動ピーク検出を実行してください。抽出されたパラメータは、新しいピークに調整されます。

その後、[分析]タブの右下にある[データのエクスポート]を選択して、使用する各電界のドットマップファイル、スプレッドシートファイル、およびPNG画像と同じフォルダーにデータをエクスポートします。1センチメートルあたり126ボルトの電気パルスは、時間の経過とともに蛍光が変化する明確な振動によって示されるように、興奮性細胞で複数の蛍光ピークを引き起こしました。電界強度が増すにつれて、応答は変化し、400ボルト/センチメートルで持続的な脱分極を示しました。

非興奮性細胞は、最も低い電界強度に応答して有意なピークを示さず、励起がないことを示しました。電界強度が高いと、非興奮性細胞も持続的な脱分極を示し、エレクトロポレーションを示しています。興奮性セルの最大ピーク数は150ボルト/センチメートルで観察され、電圧がこの点を超えて増加するにつれてピークの数は減少傾向にありました。