Name: 光遺伝学的アロステリック制御によるタンパク質活性の時空間制御 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-04T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: 学ぶ光遺伝学的アロステリック制御によるタンパク質活性の時空間制御。LightRを用いてSrcチロシンキナーゼを光で可逆的に制御し、細胞シグナル伝達と運動性の動態を解析する革新的手法を解説します。

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<meta charset="utf8"></head><body>光制御アロステリックスイッチを用いた酵素活性の光遺伝学的制御

<table><tbody><tr><td>#1.5 ガラスカバースリップ 25 mm 丸</td><td>型 ワーナーインスツルメンツ&nbsp;</td><td>〒64-0715&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mLチューブ&nbsp;</td><td>USAサイエンティフィック&nbsp;</td><td>cc7682-3394</td><td></td></tr><tr><td>2x Laemmli バッファー</td><td></td><td></td><td>500 mL用 5.18 g of&nbsp;Tris-HCL、グリセロール 131.5 mL、20% SDS 52.5 mL、ブロモフェノールブルー 0.5 g、最終 pH 6.8</td></tr><tr><td>4-20% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel</td><td>Biorad</td><td>4561096</td><td></td></tr><tr><td>5x Phusion Plus Buffer&nbsp;</td><td>サーモサイエンティフィック&nbsp;</td><td>F538L</td><td></td></tr><tr><td>60 LED顕微鏡リングライト</td><td>ボリ光学系</td><td>ML46241324</td><td>青色LED、直径60mm、5W</td></tr><tr><td>アガロース&nbsp;</td><td>GoldBiotech</td><td>A-201</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Erk 1/2 抗体</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>9102</td><td></td></tr><tr><td>抗 GAPDH 抗体</td><td>invitrogen</td><td>AM4300</td><td></td></tr><tr><td>抗 GFP</td><td>Clontech</td><td>632380</td><td></td></tr><tr><td>抗 mCherry 抗体</td><td>invitrogen</td><td>M11217</td><td></td></tr><tr><td>抗 MEK</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>9122</td><td></td></tr><tr><td>抗 p130Cas</td><td>BD Biosciences</td><td>610271</td><td></td></tr><tr><td>抗パキシリン</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>2542</td><td></td></tr><tr><td>抗リン酸化細胞 1/2 T202/Y204 抗体</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>9101</td><td></td></tr><tr><td>抗リン酸化-pY249 p130Cas</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>4014</td><td></td></tr><tr><td>抗リン酸化Y118 パキシリン</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>2541</td><td></td></tr><tr><td>アントリン酸化-S217/221 MEK</td><td>細胞シグナリング</td><td>9121</td><td></td></tr><tr><td>Arduino 互換電源</td><td>企業コンピュータ</td><td>LJH -186</td><td></td></tr><tr><td>Arduino Uno Rev3</td><td>Arduino</td><td>&lrm;</td><td></td>A000066</tr><tr><td>Attofluor Cell Chamber</td><td>invitrogen</td><td>A7816</td><td></td></tr><tr><td>Benchmark Fetal Bovine Serum (FBS)&nbsp;</td><td>ジェミニバイオプロダクツ</td><td>100-106</td><td>熱不活性化トリプル0.1&マイクロ;m 滅菌フィルター&nbsp;</td></tr><tr><td>bRaf-V600E-Venus</td><td></td><td></td> John <td>O'Bryan博士からの贈り物、MUSC</td></tr><tr><td>BSA&nbsp;</td><td>ゴールドバイオテック</td><td>A-420&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>カルベニシリン(二ナトリウム)</td><td>ゴールド</td><td>バイオテクノロジーC-103-25</td><td></td></tr><tr><td>CellMaskディープレッド原形質膜染料</td><td>invitrogen</td><td>c10046</td><td></td></tr><tr><td>コロニースクリーンマスターミックス&nbsp;</td><td>ジェネシー</td><td>42-138</td><td></td></tr><tr><td>DH5a コンピテントセル&nbsp;</td><td>NEB&nbsp;</td><td>C2987H</td><td></td></tr><tr><td>DMEM&nbsp;</td><td>コーニング&nbsp;</td><td>15-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>DNAラダー&nbsp;</td><td>ゴールドバイオ&nbsp;</td><td>D010-500</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs&nbsp;</td><td>NEB</td><td>N04475</td><td></td></tr><tr><td>Dpn1酵素&nbsp;</td><td>NEB</td><td>R01765</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>GoldBio</td><td>DTT10</td><td>DL-ジチオスレイトール、クレランド試薬&nbsp;</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>アクロス&nbsp;</td><td></td><td></td>409910250</tr><tr><td>FastLightR-bRaf-mVenus</td><td>Addgene</td><td>#162155</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血漿由来フィブロネクチン&nbsp;</td><td>シグマ&nbsp;</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>FuGENE(R) 6トランスフェクション試薬&nbsp;</td><td>Promega</td><td>E2692</td><td>トランスフェクション試薬</td></tr><tr><td>ゲルグリーン核酸染色&nbsp;</td><td>GoldBio</td><td>G-740-500</td><td></td></tr><tr><td>ゲルローディング染料パープル6x&nbsp;</td><td>NEB</td><td>B7024A</td><td></td></tr><tr><td>GeneJETゲル抽出キット&nbsp;</td><td>サーモサイエンティフィック&nbsp;</td><td>K0692</td><td>ゲル抽出キット&nbsp;</td></tr><tr><td>GeneJETプラスミドミニプレップキット</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>K0502</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>GlutaMAX-l (100x) 100 mL&nbsp;</td></tr><tr><td>HEK 293T細胞&nbsp;</td><td>ATCC&nbsp;</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>HeLa細胞&nbsp;</td><td>ATCC&nbsp;</td><td>CRM-CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>フィッシャー&nbsp;</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>IoTリレー</td><td>デジタルロガーDLI</td><td>705020645490</td><td>AC / DC制御リレー、照明用</td></tr><tr><td>カナマイシンモノサルフェートゴールド</td><td></td><td>バイオテクノロジーK-120-25</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>シグマ&nbsp;</td><td>P-4504</td><td></td></tr><tr><td>L-15 1x</td><td>コーニング&nbsp;</td><td>10-045-CV&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>LBアガー&nbsp;</td><td>フィ</td><td>ッシャーBP1425-2</td><td></td></tr><tr><td>LEDグローライトシステム</td><td>HQRP</td><td>884667106091218</td><td>LEDパネルランプシステム&nbsp;</td></tr><tr><td>LightR-bRaf-mVenus</td><td>Addgene</td><td>#162154</td><td></td></tr><tr><td>LightR-iCre-miRFP670</td><td>Addgene</td><td>#162158</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td>R2024a</td><td>CellGEOスクリプト実行ソフトウェア</td></tr><tr><td>Metamorph</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>イメージング解析ソフトウェア</td></tr><tr><td>MgCl2&nbsp;</td><td>フィッシャーケミカル</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>ミネラルオイル</td><td>シグマ&nbsp;</td><td>M5310</td><td></td></tr><tr><td>ミニプレップキット&nbsp;</td><td>遺伝子の選択&nbsp;</td><td>96-308</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN TGX プレキャストゲル 12 ウェル</td><td>Bio-Rad</td><td>4561085</td><td></td></tr><tr><td>Molecular Biology Grade Water&nbsp;</td><td>コーニング&nbsp;</td><td>46-000-CV&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>マルチバンドポリクロイックミラー</td><td>89903BS</td><td>Chroma</td><td></td></tr><tr><td>NaCl&nbsp;</td><td>フィッシャーケミカル</td><td>S271-3&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PBS w/o CaおよびMg&nbsp;</td><td>コーニング&nbsp;</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>pCAG-iCre</td><td>Addgene</td><td>#89573</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3.1_Floxed-STOP mCherry</td><td>Addgene</td><td>#122963</td><td></td></tr><tr><td>pCEFL-ERK2</td><td></td><td></td><td>Gift from Dr. Channing Der's Lab, UNC</td></tr><tr><td>PCR Tubes&nbsp;</td><td>labForce</td><td>1149Z65</td><td>0.2 mL 8 ストリップチューブおよびキャップ、硬質ストリップ個別取り付けドームキャップ&nbsp;</td></tr><tr><td>Phusion Plus DNAポリメラーゼ</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>F630S</td><td></td></tr><tr><td>pmiRFP670-N1</td><td>Addgene</td><td>#79987</td><td></td></tr><tr><td>ポリゴン400パターンイルミネーター</td><td>Mightex</td><td>DSI-G-00C</td><td></td></tr><tr><td>プライマー&nbsp;</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PVDF メンブレン</td><td>BioRad</td><td>1620219</td><td>免疫ブロット PVDF/フィルターペーパーサンドイッチ&nbsp;</td></tr><tr><td>T0.25% トリプシン、2.21 mM、eDTA、1x [-] コーニングナトリウム</td><td>&nbsp;</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>トリス-アセテート-EDTA (TAE) 50x&nbsp;</td><td>フィッシャー&nbsp;</td><td>BP1332-1&nbsp;</td><td>電気泳動用&nbsp;</td></tr><tr><td>UPlanSApo 40x 顕微鏡対物レンズ</td><td>オリンパス</td><td>1-U2B828</td><td></td></tr><tr><td>USB TTL ボックス</td><td>National Instruments</td><td>6501</td><td>TTL インターフェース</td></tr><tr><td>用&beta;-メルカプトエタノール</td><td>フィッシャー ケミカル&nbsp;</td><td>O3446I-100</td><td></td></tr></tbody></table>

光遺伝学的アロステリック制御によるタンパク質活性の時空間制御

Spatiotemporal Control of Protein Activity through Optogenetic Allosteric Regulation

LightR-Srcは、 図1A、Bで説明されている戦略に従って設計および生成されます。LightR-Srcの生化学的分析では、60分間の連続照明で青色光に応答する既知の内因性Src基質p130Cas(Y249)22 およびパキシリン(Y118)23 のリン酸化にアクセスします(図2B)。特に、トランスフェクション後16-18時間の暗闇でのみLightR-Srcを発現させた場合、Srcキナーゼのバックグラウンド活性化は観察されません。さらに、D388R変異を有するLightR-Srcの触媒的に不活性な変異体は、Src基質のリン酸化を誘導せず、リン酸化が活性型LightR-Srcによって行われ、青色光照射の非特異的な影響によって引き起こされないことを示しています(図2B)。生細胞におけるSrc27 キナーゼの振動活性の報告を認め、LightR-Srcが周期的な活性化を示すように調整できるかどうかを調べました。元のLightR-Srcは、ゆっくりとした不活性化速度を示し(図2C)、両方のVVDにI85V変異を持つ新しい変種であるFast-LightR-Srcの生成を促しました。 図2D は、Fast-LightR-Srcが著しく速い不活性化速度を示し、LightR-Srcが1時間以上光を消してから10分以内に完全に不活性化することを示しています。FastLightR-Srcを使用することで、活性化/不活性化のサイクルを繰り返すこともできました(図2E)。これらの結果は、LightRツールが生細胞内のSrc活性を特異的かつ厳密に制御する制御を達成する能力を総合的に示しています。
FastLightR-Srcの適用により、細胞の形態力学に対する一過性のSrc活性化の影響を評価することもできます。HeLa細胞でFastLightR-Srcが活性化されると細胞拡散が誘導され、FastLightR-Srcが不活性化されるとすぐにこのプロセスが停止します。活性化すると、FastLightR-Srcが核周囲コンパートメントから焦点接着および原形質膜への転座を観察しました。これは、野生型Srcキナーゼ11,12が示す挙動です。触媒的に不活性な変異体D388RLightR-Srcを発現する照明細胞は、そのような拡散効果を示さない(図3B、C)。このことから、FastLightR-Srcは野生型と同様に機能することがさらに確認されています。細胞領域の局所的な照明は、局所的な蓄積によって示されるFastLightR-Srcの局所的な活性化をもたらし、焦点接着におけるLightR Srcの局所的な活性化をもたらし、局所的な膜突起の形成を伴います(図4B(i)、(ii))および細胞重心シフト(図4C(i)、(ii))その結果、細胞が光に向かって移動します。Srcキナーゼの制御のためのLightRツールのアプリケーションを確立した上で、bRafキナーゼとDNAリコンビナーゼCreの制御にまで及ぶLightRの幅広い有用性を紹介します。LightR-bRafの解析では、bRafの内因性基質であるMEK1の光誘起リン酸化、およびERK1/2キナーゼ24,25の下流のリン酸化が、恒常的に活性なbRaf変異体(V600E)のリン酸化に匹敵するレベルで行われていることが示されています(図5A)。逆に、触媒的に不活性なD575RLightR-bRafは、非照明LightR-bRafサンプルに匹敵するMEK1およびERK1/2リン酸化を示さず、LightR-bRaf調節の特異性を確認しています。ライブセルイメージングは、FastLightR-bRafの活性化/不活性化のサイクルを繰り返すと、ERK2の核内外への反復的な転座が誘導されることを示し、bRaf活性化の既知の結果と裏付けています28(図5B)。LightR-Creの活性化により、レポーターmCherry遺伝子の組換えが成功し、LightRのさまざまなクラスの酵素への適用性が実証されています(図5C)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67261/67261fig01.jpg"> 
図1:LightRアプローチの開発戦略 (A)暗状態の2つのVividモノマー(PDB:2PD7)と点灯状態のダイマー(PDB:3RH8)の結晶構造。(B)LightRデザインの漫画表現。触媒ドメインに挿入された2つのタンデム結合VVD光受容体は、暗闇でのタンパク質の触媒活性を混乱させます。青色光に応答したVVDの二量体化は、タンパク質活性を回復させます。(C)(i)Src(PDB 1Y57)、および(ii)bRaf(PDB 4MNF)触媒ドメインの結晶構造。(ii) Creリコンビナーゼ(PDB 1MA7)の構造。黄色の矢印はLightR挿入部位を示し、置換されたアミノ酸を示します。(D)標的酵素配列19へのLightRドメイン挿入のためのクローニング戦略の模式図。ステップ1では、挿入部位の前後に標的遺伝子でアニーリングする部位に隣接するLightRフラグメントのPCR合成に、特別に設計されたプライマーを使用します。ステップ2では、このようにして作製されたLightRフラグメントが、Quick change部位特異的突然変異導入により、標的酵素遺伝子にLightRを挿入するための「メガプライマー」として使用されることが示された。パネルA-Cは、Shaayaらの許可を得て適応および変更されています10。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/67261fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67261/67261fig02.jpg"> 
図2:遺伝子操作されたLightRタンパク質の生化学的特性評価 (A)LightR Srcの生化学的特性評価のための実験プロトコルの概略図 (B)C末端にmCherryとmycタグを持つLightR Srcコンストラクトを一過性に発現するLinXE細胞を、465 nm LEDセットアップを使用して60分間連続的に青色光で照射した。細胞ライセートをプローブして、Src基質、パキシリン、およびp130Casのリン酸化を調べました。ウェスタンブロットの結果は、生細胞におけるLightR-Srcの活性化に応答した内因性パキシリンおよびp130Casのリン酸化を示しています。(C,D)C末端にタンデムmCherry-mycタグを持つ示されたLightR-Srcコンストラクトを一過性に発現するLinXE細胞を、指定時間(0分および30分)連続的に青色光に曝露した後、指定された時間だけ暗所に置きました。細胞ライセートをSrc基質のリン酸化についてプローブし、(C)LightR-Srcと(D)FastLightR-Srcの間の活性化と不活性化の動力学の比較を示しました。(E)示されたLightR-Srcコンストラクトを一過性に発現するLinXE細胞を、C末端にタンデムmCherry-mycタグを付加し、青色光を20分間連続的に照射した後、暗所で10分間インキュベートし、光中で20分間インキュベートを繰り返した。細胞ライセートを採取し、Src基質のリン酸化についてプローブし、Srcキナーゼの活性化状態と不活性化状態の間のサイクリングの効率を示しました。すべての実験を少なくとも3回繰り返し、同様の結果を得た。各ウェスタンブロットパネルB-Eの横に表示されている数字は、タンパク質の分子量を表しており、キロダルトン(kDa)で測定されています。パネルB-Eは、Shaayaらの許可を得て適応および変更されています10。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/67261fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67261/67261fig03v3.jpg"> 
図3:FastLightR-Srcの活動に対する全球的および時間的照明の制御と影響 (A)全球的および時間的周期的照明の実験スキームとその後のデータ解析の漫画表現。(B,C)広視野蛍光顕微鏡を用いたタイムラプスシリーズから得られたHeLa細胞の代表的な画像には、青色光による細胞形態の制御とFastLightR-Srcの局在が描かれています。これらの細胞は、Stargazin-iRFP670(原形質膜マーカー)とともに、FastLightR-Src-mCherry-myc(N = 10細胞)または触媒的に不活性なD388RLightR-Src-mCherry-myc(N = 9細胞)を一過性に共発現していました。生細胞イメージングは、細胞全体に青色光(青色の輪郭)を照射しながら、1分ごとに行われました。(B)黄色の矢印は、焦点接着に似た構造でのFastLightR-Srcの局在を示しています。画像は、広視野蛍光顕微鏡を用いたHeLa細胞のタイムラプスシリーズから得られたものです。(C)FastLightR-SrcとD388RLightR-Srcの活性化によって誘発される細胞領域の変化の定量化を各パネルに示します。イルミネーション ウィンドウは青い四角形で示されます。グラフは平均±90%の信頼区間を表します。パネルBとCは、Shaayaらの許可を得て改変・改変されたものです10。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/67261fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67261/67261fig04.jpg"> 
図4:局所的な細胞内照明制御とFastLightR-Src活性への影響。 (A)局所的な細胞内照明制御の実験スキームの漫画表現。(B) (i) FastLightR-Src-mCherryを発現するHeLa細胞を青色光で局所的に照射したタイムラプスシーケンス(青色の円で示)。画像は、全反射蛍光顕微鏡(60倍対物レンズ)を使用して毎分撮影されました。画像は、指定された時間間隔で取得された反転コントラスト画像として表示されます。(ii)指定された時間間隔で形成された突起を示す細胞投影画像。実験のタイムライン上で細胞形態を閾値化し、マスキングすることは、細胞の拡散と細胞エッジのダイナミクスを解析するためのプラットフォームを表しています。セルの指定された照らされた領域は、青い円で囲まれています。(C) (i) 局所的な青色光照明に対する重心の移動距離 (d) と偏差角 (θ) を表すセルの極プロット。黒い点は、触媒的に不活性なD388RLightR-Src(N=6細胞)またはFastLightR-Src(N=10細胞)を発現する個々のHeLa細胞を表しています。(ii)局所的な青色光刺激の開始(1)から結論(2)まで細胞の重心が移動した重心シフト距離(d)を示す概略図。偏差角(θ)は、青色光の位置からのセルの重心移動の発散の程度を示します。薄い灰色の陰影は、局所的なFastLightR-Src刺激に応答して細胞が突出した領域を示しています。セルの指定された照らされた領域は、青い実線の円で示されます。パネルBおよびCは、Shaayaら10から適応および修正されています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/67261fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67261/67261fig05.jpg"> 
図5:LightRアプローチの幅広い適用性。 (A)LightR-bRafの制御。LightR-bRaf-Venus、触媒的に不活性なD575R LightR-bRaf Venus、または構成的に活性なbRaf(V600E)-Venusを一過性に発現するLinXE細胞を、指定された時間連続的に青色光に曝露した。細胞ライセートを、示されたタンパク質のリン酸化についてプローブしました。(B)広視野蛍光顕微鏡を用いた一連の生細胞イメージングのタイムラプスから得られた代表的な画像は、FastLightR-bRaf-VenusとmCherry-ERK2を一過性に共発現するLinXE細胞における全球的な青色光応答の制御を示しています。これらの細胞は、青色の輪郭で描かれた指定された時間、青色光(毎秒50ミリ秒のパルス、毎分50パルス)で全球的に照らされました。mCherry-ERK2の生細胞イメージングを毎分実施しました。黄色の矢印は、操作されたbRafの青色光活性化によって誘導される核ERK2局在の段階を示しています。(C)LinXE細胞をFloxed-stop-mCherryレポーターおよびLightR-Cre-iRFP670と一過性に同時トランスフェクトした。細胞は、暗い条件またはパルス状の青色光(2秒オン、10秒オフ)のいずれかに最大8時間さらされました。各チャンネルのすべての時点の画像は、広視野蛍光顕微鏡(10倍対物レンズ)を使用して同じ設定で取得し、サンプル間のタンパク質発現レベルの比較を容易にするために、一貫した輝度とコントラストレベルに調整しました。実験を少なくとも3回繰り返し、同様の結果を得ました。この図は、Shaaya et al.10から適応および修正されています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/67261fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
補足表1:LightR配列。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足表2:LightR挿入部位の説明とLightR-Protein設計のチェックリスト。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/Supplementary%20Table%202.xlsx" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足表3:LightRクローニング用プライマー。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/Supplementary%20Table%203.xlsx" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足表4:LightR-Protein活性の生化学的分析のためのトランスフェクション条件。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/Supplementary%20Table%204.xlsx" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足表5:LightR-Protein活性のイメージングベースの分析のためのトランスフェクション条件。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/Supplementary%20Table%205.xlsx" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル1:統合開発環境(IDE)を使用したパルス照明。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/Supplementary%20File%201.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル2:顕微鏡の照明設定。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/Supplementary%20File%202_Updated.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

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