Dynamin様GTPaseアトラスチンのコンフォメーションダイナミクスを観察するための1分子FRETイメージング
2025年1月24日
ダイナミンスーパーファミリータンパク質の機能は、GTP加水分解と組み合わせたコンフォメーション変化に依存します。1分子FRET(smFRET)技術を用いて、異なるヌクレオチド負荷状態におけるダイナミン様GTPaseアトラスチンのコンフォメーションダイナミクスをモニターするシステムについて記述します。
私たちは、細胞内膜の融合機構の研究に取り組んでいます。このプロトコールでは、小胞体膜融合タンパク質atlastinのGTP加水分解サイクル中のコンフォメーションダイナミクスをsmFRETにより実現することを目指しています。アトラスチンは、GTP加水分解サイクルにおいてモノマーまたはダイマーとして存在する可能性があります。
1分子実験では、適切なタンパク質標識および固定化戦略を見つけることは困難であり、以下ではGTP加水分解サイクル全体にわたるアトラスチンのコンフォメーションダイナミクスを示します。バルクFRETと比較して、smFRETはさまざまなヌクレオチド負荷状態でタンパク質の立体配座を正確に監視できるため、モジュレーター分子の挙動を直接把握することができます。smFRETを使用して、さまざまなポジション戦略におけるアトラスチンのGTP加水分解サイクルを完全に解決しました。
私たちの発見は、GTP加水分解タンパク質の研究においてよりコンフォメーションダイナミクスを促進し、まれな生物学的プロセスの新しい解釈を提供すると信じています。カバーガラスの表面を清掃するには、ピンセットを使用して8枚のカバーガラスを拾い上げ、染色瓶に入れます。50ミリリットルのアセトンをカバーガラスに覆い、染色ジャーを超音波洗浄機に30分間置きます。
カバーガラスを二重蒸留水で3回すすぎ、超音波洗浄機でメタノールで洗います。次に、染色瓶にピラニア溶液を加え、95°Cの水浴釜で2時間加熱します。ジャーを室温に冷却した後、カバースリップを二重蒸留水で6回すすいでください。
ナトリウムメトキシド溶液を染色ジャーに加え、超音波洗浄機に15分間入れます。カバーガラスを水ですすいだ後、染色ジャーに二重蒸留水を加え、超音波洗浄機に15分間入れます。カバースリップを染色ジャーにクランプし、窒素で乾燥させます。
乾燥させたカバースリップを別の染色瓶に移し、120°Cの乾燥オーブンで30分間焼きます。次に、デシケーターで瓶を室温に冷却します。ビーカーにメタノール47.5ミリリットル、酢酸2.5ミリリットル、トリエトキシシラン0.5ミリリットルを加え、均一に混ぜます。
混合物を染色ジャーに移し、10分間インキュベートします。カバースリップを染色ジャー内の二重蒸留水で3回すすぎ、5分間超音波処理します。図のようにカバーガラスを水ですすぎ、窒素で乾燥させた後、直径10cmのシャーレに入れます。
SVA-mPEGとSVA-mPEG-ビオチンを高塩溶液に1:100の割合で溶解します。準備したミックスをカバースリップに落とし、別のカバースリップで覆います。カバーガラスを適切な湿度で2時間または一晩インキュベートします。
改質後、カバーガラスを分離し、脱イオン水ですすぎ、窒素でブロードライします。修正したカバースリップを50ミリリットルのチューブに慎重に入れます。Rosetta E.coli細胞で発現するダイナミン様タンパク質アトラスチンまたはATLのGTPaseドメインを精製した後、10キロダルトン遠心フィルターを使用して、タンパク質バッファーをタンパク質ビオチン化バッファーに変更します。
タンパク質のビオチン化には、100ミリモルATP、100ミリモルの酢酸マグネシウム、500マイクロモルのD-ビオチン、100マイクロリットルのBirAビオチンリガーゼ10マイクロリットル、および50マイクロモルのタンパク質をそれぞれ100マイクロリットル混合して、最終容量を1ミリリットルにします。混合物を摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日、分子量10キロダルトンのカットオフ遠心フィルターを使用して遊離D-ビオチンを除去します。
20マイクロリットルのビオチン化タンパク質と20マイクロリットルの15マイクロモルストレプトアビジンを氷上で20分間インキュベートします。SDS-PAGEを使用してタンパク質のビオチン化の効率を検出します。LD555およびLD655フルオロフォアをジメチルスルホキシドに溶解し、最終濃度5ミリモルにします。
標識緩衝液を調製するには、25ミリモルのHEPES、150ミリモルの塩化カリウム、および5ミリモルの塩化マグネシウムを混合します。タンパク質バッファーを標識バッファーに交換するには、10キロダルトンの遠心フィルターを使用します。分子内smFRETアッセイでは、ATL1cyto-TKをLD555およびLD655と1:1.2:1.2の比率で混合し、最終容量を100マイクロリットルにします。
混合物を摂氏4度で5時間インキュベートします。分子間smFRETアッセイでは、ATL1cyto-KをLD555とインキュベートし、ビオチン化ATL1cyto-KをLD655とインキュベートし、摂氏4度で5時間インキュベートします。タンパク質固定化チャンバーを準備するには、改変したカバースリップと顕微鏡スライドをカスタマイズされた両面テープで慎重に貼り付けます。
ホースとチップを取り付けて、6つのチャネルを持つマイクロ流体チャンバーを形成します。マッピング補正には、顕微鏡スライドに10マイクロリットルの10%ポリスチレン粒子を追加し、カバースリップで覆います。次に、全反射蛍光顕微鏡で、ポリスチレン粒子を含む視野を選択し、明視野モードでビデオを撮影します。
カスタムスクリプトを使用して、ドナーチャネルとアクセプターチャネルの両方で同じポリスチレン粒子の中心位置を揃えます。マップファイルをTXTファイルとして保存します。分子間smFRET実験では、LD555標識ATL1cyto-KとLD655標識ATL1cyto-K-ビオチンを1対1の比率で混合し、最終濃度はGTP-γ-Sの1ミリモルです。
混合物を氷上で1時間インキュベートして、タンパク質を二量体化します。ATL1cyto-TおよびATL1cyto-K分子間smFRET実験では、LD555標識ATL1cyto-TとLD655標識ATL1cyto-K-ビオチンを1ミリモルのGTP-γ-Sと1対1の比率で混合します。混合物を氷上で1時間インキュベートして、二量体化タンパク質を得ます。
次に、分子内smFRETアッセイのために、LD555およびLD655標識ATL1cyto-TKを1ミリモルのGDPと氷上で1時間インキュベートします。分子間実験では、ストレプトアビジン1ミリリットルあたり10マイクログラムを10分間インキュベートしてタンパク質を固定化します。分子内アッセイでは、1ミリリットルあたり10 μgのビオチン化抗His抗体を添加し、10分間インキュベートしてタンパク質を固定化します。
インキュベーション後、希釈したATL1二量体をチャネル内のタンパク質に加え、10分間固定化します。チャンネルをインキュベーションバッファーで2回フラッシュします。安息香酸とPCDを最終濃度2.5ミリモルでチャネルに添加します。
励起光源として532ナノメートルレーザーを選択します。30 ミリ秒のフレーム間隔でデータを記録するように EMCCD カメラを設定します。撮影した動画を16ビットTIFF形式で保存します。
データ取得後、録画した動画からFRETトラックを抽出します。FRETトラックをTXT形式で選択して保存します。TXTファイルからデータを抽出し、MATLABの自作スクリプトを使用してFRET値を計算します。
OriginのGaussAmpでsmFRETデータをフィットし、分布ヒストグラムを取得します。
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概要
この研究では、単分子FRET（smFRET）を用いて、GTP加水分解サイクル中の内因性小胞体膜融合タンパク質であるatlastinのコンホメーションダイナミクスを調査しています。この研究は、単分子実験におけるタンパク質ラベリングと固定化戦略の課題を強調しています。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 生物物理学
背景
- ダイナミンスーパーファミリータンパク質は膜融合に不可欠です。
- AtlastinはGTP加水分解中にモノマーまたはダイマーの形態で存在できます。
- 単分子FRETはタンパク質構造に関する洞察を提供します。
- Atlastinのダイナミクスの理解は膜融合メカニズムの解明に不可欠です。
研究目的
- GTP加水分解中のatlastinのコンホメーション変化を探索する。
- 様々なヌクレオチド負荷状態下でタンパク質ダイナミクスをモニタリングするためにsmFRETを活用する。
- 単分子研究におけるタンパク質ラベリングと固定化の課題に取り組む。
使用した方法
- 単分子FRET（smFRET）技術。
- タンパク質ラベリングのための実験戦略。
- 単分子実験のための固定化技術。
- GTP加水分解サイクルダイナミクスの分析。
主要な結果
- smFRETはatlastin構造を効果的にモニタリングします。
- 異なるヌクレオチド負荷状態がatlastinダイナミクスに影響を与えます。
- ラベリングと固定化の課題に対処しました。
- AtlastinのGTP加水分解サイクルに関する洞察が得られました。
結論
- smFRETはタンパク質ダイナミクスを研究するための強力なツールです。
- Atlastinのコンホメーション変化を理解することで膜融合メカニズムの把握に役立ちます。
- 将来の研究はこれらの知見を基に、他のダイナミン様タンパク質を探索することができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Single-molecule FRET (smFRET) imaging of atlastin provides direct, quantitative insight into the conformational dynamics underlying GTPase-driven membrane fusion, a process relevant to neurodegenerative disease mechanisms. This approach enables high-resolution interrogation of mechanochemical protein function, supporting predictive confidence in early-stage target validation and mechanistic de-risking. The method's precision in monitoring nucleotide-dependent conformational states positions it as a reusable capability for biopharma discovery pipelines focused on membrane fusion and GTPase biology.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct observation of conformational transitions in disease-relevant GTPases.
- Supports mechanistic de-risking by linking nucleotide state to structural dynamics.
- Facilitates functional target validation through real-time single-molecule analysis.
- Improves predictive confidence for portfolio triage of membrane fusion targets.
Screening & Assay Development
- Establishes validated single-molecule assays for quantitative conformational readouts.
- Enables reproducible measurement of protein dynamics under defined nucleotide states.
- Supports assay standardization for downstream screening of modulators or inhibitors.
- Provides a platform for scalable, high-content mechanistic screening.
Translational & Preclinical Research
- Aligns conformational biomarkers with disease-relevant mechanistic endpoints.
- Ensures continuity from molecular discovery to preclinical validation of GTPase function.
- De-risks advancement decisions by providing quantitative mechanistic evidence.
- Supports translational research into rare neurodegenerative disorders linked to atlastin dysfunction.
Pipeline & Workflow Integration
smFRET imaging of atlastin integrates into the discovery continuum from early mechanistic studies through assay development and translational research, enabling iterative hypothesis testing and functional validation.
- Discovery Biology: Provides quantitative evidence for conformational changes during GTP hydrolysis, clarifying mechanistic pathways.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative FRET outputs for comparative analysis of nucleotide states and modulators.
- Analytics: Generates high-content single-molecule data for statistical comparison of protein conformations.
- Translational Research: Links molecular dynamics to disease-relevant phenotypes in neurodegeneration.
- Enterprise Reuse: Offers a modular platform for studying other mechanochemical proteins beyond atlastin.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes single-molecule assay workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by de-risking early targets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of membrane fusion and GTPase-related programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in single-molecule fluorescence and protein biochemistry.
- Demands specialized instrumentation such as TIRF microscopy and EMCCD cameras.
- Necessitates rigorous cross-team standardization of labeling and immobilization protocols.
- Adaptation to other mechanochemical proteins may require optimization of labeling strategies.
- Throughput and data analysis depend on robust computational infrastructure and custom scripts.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:22
Preparation and Modification of Coverslips for Protein Immobilization in Chambers
4:12
Protein Biotinylation and Fluorophore Labeling for Single-Molecule Frster Resonance Energy Transfer (smFRET) Assays
6:41
Single-Molecule FRET Imaging and Data Analysis for GTP Hydrolysis Cycle of Atlastin
