腸間膜虚血再灌流障害後の腸間小静脈における好中球細胞外トラップの生体内顕微鏡による可視化

血栓症の発症と発症における特定の遺伝子の役割、この場合、虚血再灌流障害に対する内皮PAR1の発現を調査します。虚血後と再灌流中の両方で、内皮が反応に及ぼす影響を特定しようとします。これまで十分に研究されていない非常に重要な側面は、腸間膜虚血再灌流障害における腸共生の役割を特定することです。

この疑問を研究するために、私たちのグループは、生体内顕微鏡法と腸間膜虚血再灌流障害モデル、およびそれを無菌マウスモデルと組み合わせました。トランスジェニックマウスに血栓症モデルを適用し、生体内顕微鏡法と組み合わせることで、このような技術により、疾患の発症時の細胞挙動をin vivoで観察することができます。生物に対して実験モデルを実行することは、性別、年齢、麻酔治療、動物福祉規則の変更など、多くの要因に影響を受けるため、常に課題です。

また、血栓症の研究は前世紀に始まりました。多くの要因はまだ解決されていません。私のグループは、血栓症、アテローム性動脈硬化症、血小板機能、および血管新生に対する腸内細菌叢の役割を研究しています。

まず、麻酔をかけた剃毛マウスを加熱パッドの背側横臥位に置きます。マウスをノーズコーンを介して酸素システムに接続します。マウスの手足をサージカルテープで加熱されたパッドに固定します。

頸静脈にカテーテルを埋め込むには、気管を横切開します。首を覆っている皮膚を取り除き、右頸静脈を分離します。次に、5センチの絹糸を使用して、静脈の遠位端を閉じ、外科用鉗子で固定します。

静脈の約2センチメートル下に3本の絹糸を配置し、1本は遠位端近くに、2本は頸静脈の近位端近くに配置します。外科用結び目を結びますが、血管を閉じないでください。ポリエチレンカテーテルに0.9%塩化ナトリウムを入れます。

気泡を取り除き、1ミリリットルの注射器に差し込みます。ハサミを使って2番目と3番目の結び目の間に穴を開け、カテーテルを頸静脈に埋め込みます。シリンジを吸引して、カテーテルに血液が存在することを確認します。

絹糸を結んでカテーテルを静脈に固定します。次に、医療用テープを使用してシリンジを固定します。1ミリリットルのシリンジに、0.5ミリグラム/ミリリットルの最終濃度のアクリジンオレンジと5マイクロモルの濃度の核酸染料を入れます。

好中球細胞外トラップ(NET)のために50マイクロリットルのSYTOX Orangeを注入します。マウスの腹部の皮膚を、ヨウ素ベースのスクラブとアルコールを交互に繰り返して消毒します。次に、メスを使用して、線形アルバに沿って3〜5センチメートルの開腹術を行います。

生理食塩水で湿らせた2つの綿の先端を使用して、腸を腹腔からそっと配置し、脂肪の被覆が最小限に抑えられる場所を特定します。腸の小さな枝を黒い生地の上に配置して、バックグラウンドシグナルを減らします。頸静脈カテーテルから50マイクロリットルのアクリジンオレンジを注入して、染色された白血球を視覚化します。

虚血再灌流前の腸のビデオを取得します。塩化ナトリウムで湿らせた湿布を準備し、その中に腸を置きます。小さな血管クランプで上腸間膜動脈を閉塞します。

生理食塩水で湿らせた綿棒を使用して、腸を腹腔内にそっと押し戻します。7-0縫合糸を使用して腹壁を閉じ、水分と温度の損失を防ぎます。1時間後、縫合糸を抜く。

虚血期の後、切り取られた領域に生理食塩水を数滴塗布します。次に、クリップアプライヤーを使用して微小血管クリップをそっと取り外します。生理食塩水で湿らせた綿の先端を使用して、腸を腹腔から再び穏やかに配置し、静脈の小さな枝を黒い生地の上に置きます。

50マイクロリットルのアクリジンオレンジを注入し、静脈の虚血後ビデオを撮影します。長距離コンデンサー、モノクロメーター、10倍水浸対物レンズ、電荷結合デバイスカメラを搭載した高速広視野蛍光顕微鏡の電源を入れます。露光時間を30ミリ秒に設定し、Alexa Fluor 488フィルターとRhodamine Redフィルターが取り付けられた5Bチャンネルを選択して、白血球とNETを視覚化します。

0.06平方ミリメートルの関心領域内の細胞動員を定量化します。次に、20秒間の観察期間中に静止した細胞または内皮内層に付着した細胞をカウントすることにより、接着性白血球を定量します。白血球と核酸の両方の蛍光色素で標識されたNETを同定します。

虚血性腸間膜内皮への白血球の接着は、虚血再灌流障害後の野生型およびF2r デルタEC群の両方で増加し、F2r デルタEC群では接着が著しく低下し、白血球の動員における内皮PAR1の役割を示唆しています。虚血再灌流障害後、NETsは、内皮細胞上でPAR1の正常レベルを発現する野生型グループでのみ観察され、NETosisにおけるPAR1の制御的役割を示しています。