Name: 腸間膜虚血再灌流障害後の腸間小静脈における好中球細胞外トラップの生体内顕微鏡による可視化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-27T14:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: 学ぶ 腸間膜虚血再灌流障害における血管内皮PAR1の役割と好中球細胞外トラップ形成の動態を、生体内顕微鏡を用いてマウスモデルで可視化する方法。腸内細菌群の影響も評価します。

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<meta charset="utf8"></head><body>I/R損傷時の白血球接着とNET形成における内皮PAR1の役割

<table><tbody><tr><td>アクリジンオレンジ</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>&nbsp;A-6014</td><td></td></tr><tr><td>96ウェルプレート乗算型PCR-プラッテン&nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>721977202.00</td><td></td></tr><tr><td>げっ歯類のための麻酔システム</td><td>GROPPLER medizintechnik</td><td>Uni Vet -Porta T-8</td><td></td></tr><tr><td>Aqua ad injectabilia IVM</td><td>B Braun Melsungen</td><td>53402101</td><td></td></tr><tr><td>黒い生地</td><td>Staedtler</td><td></td><td>モデリング粘土</td></tr><tr><td>CD146 Microビーズ、マウス</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-007</td><td></td></tr><tr><td>cellSens</td><td>オリンパス</td><td>オリンパス cellSense Dimension Desktop 2.3</td><td>ソフトウェア</td></tr><tr><td>電荷結合デバイス カメラ</td><td>浜松ホトニクス</td><td>ORCA-R2</td><td>カメラ</td></tr><tr><td>綿棒</td><td>B&ouml;ttger</td><td>09-119-9100</td><td></td></tr><tr><td>カーブ止血 125mm/5インチ</td> <td>インディゴインスツルメンツ&nbsp;</td><td>22466</td><td></td></tr><tr><td>脱毛クリーム</td><td>バレア</td><td>該当</td><td></td>なし</tr><tr><td>Dorbene Vet</td><td>zoetis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont 鉗子</td><td>ファイン サイエンス ツール</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>エタノール p.a. 99,5 %</td><td>Roth</td><td>5504.20</td><td></td></tr><tr><td>エクストラ ナロー ハサミ &ndash;ストレート/シャープシャープ/10.5</td><td>FST</td><td>14088-10</td><td></td></tr><tr><td>フェンタニル</td><td>ヤンセン-Cilag GmBH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>鉗子 "Dumont #5" (Inox、先端 0.1mm、長さ 11 cm)</td><td>FST</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>GentleMACS C チューブ</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-236</td><td></td></tr><tr><td>Graphpadprism</td><td>Graphpad</td><td>Prism 10</td><td>ソフトウェア</td></tr><tr><td>イソフルラン&nbsp;</td><td>Piramal</td><td>4150097146757.00</td><td></td></tr><tr><td>iTaq UniversalSYBRグリーンSupermix 10x5ml</td><td>BioRad</td><td>1725125.00</td><td></td></tr><tr><td>Leukofix医療テープ</td><td>BSNMedical</td><td>0213600</td><td></td></tr><tr><td>肝臓解離キット、マウス</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-105-807</td><td></td></tr><tr><td>LS分離カラムMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MACSスマートストレーナー100 & マイクロ;m</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-463</td><td></td></tr><tr><td>マイクロシール B シール シール</td><td>Biorad</td><td>MSB1001</td><td></td></tr><tr><td>Midazolam</td><td>hameln</td><td>5918501.00</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Braun</td><td>2350748</td><td></td></tr><tr><td>ニードル ホルダー</td><td>FST</td><td>12001-13</td><td></td></tr><tr><td>非吸収性編組シルク縫合糸、サイズ: 7/0、91 メートル&nbsp;</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>18020-70</td><td></td></tr><tr><td>オリンパス BX51WI 蛍光顕微鏡</td> オ<td>リンパス</td><td></td><td>顕微鏡</td></tr><tr><td>チューブストリップ用 PCR</td><td>サーシュテット</td><td>72985002.00</td><td></td></tr><tr><td>PCR チューブ蓋</td><td>サーシュテット</td><td>65989002.00</td><td></td></tr><tr><td>プライエチレンカテーテル</td><td>スミスメディカル ドイツ GmbH</td><td>800/100/100</td><td></td></tr><tr><td>プロレン (8648G)、ポリプロピレン 6-0、ナートマテリアル&nbsp;</td><td>ジョンソン&ジョンソンメディカルGmbH&nbsp;</td><td>8695H</td><td></td></tr><tr><td>Relia Prep RNA Miniprep Systems</td><td>Promega</td><td>Z6112</td><td></td></tr><tr><td>Reverse Tanscription Kit (High Capacity cDNA)</td><td>Applied Biosystems</td><td>4368813.00</td><td></td></tr><tr><td>学校規模&nbsp;</td><td>カーン&SOHN GmbH</td><td>EMB 500-1</td><td></td></tr><tr><td>スプリングハサミ - 側面への角度</td><td>FST</td><td>15006-09</td><td></td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>M50</td><td></td></tr><tr><td>ストレート止血剤 135mm/5.5"</td><td>インディゴインスツルメンツ&nbsp;</td><td>22468</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ1 mL</td><td>ブラウン</td><td>9166017V</td><td></td></tr><tr><td>SYTOXオレンジ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>S11368</td><td></td></tr><tr><td>温度コントローラーTC-1000</td><td>FMI F&ouml;hr Medical Instruments GmbH</td><td>該当</td><td></td>なし</tr><tr><td>組織鉗子 - 1x2 歯</td><td>FST</td><td>18057-14</td><td></td></tr><tr><td>血管クランプ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>18055-02</td><td></td></tr><tr><td>ベティバミニ</td><td>WAHL</td><td>1584-0480</td><td></td></tr></tbody></table>

腸間膜虚血再灌流障害後の腸間小静脈における好中球細胞外トラップの生体内顕微鏡による可視化

Visualization of Neutrophil Extracellular Traps in Mesenteric Venules After Mesenteric Ischemia-Reperfusion Injury via Intravital Microscopy

白血球のローリングと接着、およびNET形成に対する内皮細胞依存性の影響を研究するために、最初に、VE-Cadherin Cre誘導性 F2r欠損症の有効性を内皮細胞で調べました。磁気細胞ソーティングを用いて、肝内皮細胞を単離した。続いて、RNAを単離し、続いて定量的リアルタイムPCR(qRT-PCR)を行った。VE-カドヘリンプロモーターの制御下で発現したCre組換え酵素が存在しない F2rΔEC マウスは、WTコントロールと比較して F2r (PAR1)mRNAレベルが有意に減少(約3分の1)しました(図1)。
マウス系統の欠損を確認した後、腸間膜I/R損傷を行い、血管内皮細胞によって発現されるPAR1が白血球のローリングと接着に及ぼす影響を調べ、生体内顕微鏡で可視化しました(図2A、B)。虚血の1時間後、クランプを取り外し、血管を再灌流させた。白血球の転がりと接着が観察され、記録されました(緑色に染色され、白い矢印で示されています)。両群ともI/R損傷後に付着性白血球数の増加を示したが、内皮 F2r (PAR1)の欠損により、I/R活性化腸間膜内皮への白血球接着は著しく減少したが、有意ではなかったことから、虚血性腸間膜細静脈への白血球動員における内皮PAR1活性化の積極的な役割が示唆された(図2C)。
次の目的は、内皮性PAR1の発現がI/R損傷によるNET形成を制御しているかどうかを調べることでした。そこで、細胞外核酸を細胞不透過性色素30で染色し、生成されたNETを生体内顕微鏡(黒矢印で示)を用いて可視化した(図2A,B)。I/R損傷後、NETは、内皮細胞上でPAR1の正常レベルを発現するWTグループでのみ観察され、NETosisにおけるPAR1の調節的役割を示しています(図2C、D)。特に、内皮F2rの発現が抑制された場合、I/R損傷した腸間膜細静脈にはNETは存在しませんでした。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67264/67264fig01.jpg"> 
図1:F2r(PAR1)mRNA発現。 L32ハウスキーピング遺伝子に対するWT(n=6)およびF2rΔEC(n=9)マウスのF2r肝臓内皮細胞の発現。データは、95%の信頼区間を持つ中央値として表示されます。マンホイットニー検定は、2つの独立したグループ、*p&lt;0.05を比較するために使用されました。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67264/67264fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67264/67264fig02.jpg"> 
図2:内皮PAR1は、I/R損傷した腸間小静脈における白血球の接着とNET形成に影響を与えます。I / R損傷の前(前)および後(後)のI / R損傷(A)10倍および(B)20倍の倍率。スケールバー:A、50μm;(C)白血球接着性および(D)WT(n=7)およびF2rΔEC(n=4)マウスのmm当たりの純数(1mmあたり)(n=7)およびI/R損傷前(前)および後(後)のマウス。すべてのデータは、95%信頼区間の中央値として表されました。統計的比較は、二元配置ANOVA検定、**p&lt; 0.01、およびSídákの多重比較検定を使用して実行され、各時点(虚血前と虚血後)の異なる遺伝子型の平均を比較しました。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67264/67264fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

Intestinal ischemia-reperfusion (I/R) injury is an acute condition characterized by tissue damage resulting from restricted blood flow to the mesenteric ...

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