Name: ゼブラフィッシュ幼生の発育中の骨芽細胞の2光子レーザー媒介アブレーション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-06T14:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 46 s
Description: 学ぶ ゼブラフィッシュ幼生の骨芽細胞を用いた2光子レーザーアブレーション法で、骨再生と免疫応答のメカニズムを解明します。この手法は再生医療研究に有用です。

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この研究プロトコルは、Landesdirektion Sachsenから承認を受けました。許可番号は25-5131/564/2、DD25-5131/450/4、25-5131/496/56、DD25.1-5131/354/87です。使用されたゼブラフィッシュの系統は、国内法に従って、前述の27,28の標準化された条件下で維持されました。本試験で使用したすべての試薬および機器の詳細は、材料表に記載されています。
1. 材料と溶液の調製
<ol><li>胚を1x E3培地で維持します。1x E3培地を調製するには、60x E3ストック170 mLを10 Lの脱イオン水で希釈し、2 mLの0.1%メチレンブルーを加えます。<ol><li>17.2 gのNaCl、0.76 gのKCl、2.90 gのCaCl2.2 H2O、4.90 gのMgSO4.7 H2Oを1 Lの脱イオンオートクレーブ水に混合して、60x E3培地ストックを調製します。</li>
	</ol></li>
	<li>幼虫の包埋には、あらかじめ1%低融点アガロース(LMA)のアリコートを調製し、室温で保管してください。<ol><li>アリコートを調製するには、LMAを1x E3培地(例:500 mgのLMA、3x E3の50 mLに三角フラスコ)に溶解し、アガロースが完全に溶解するまで溶液を電子レンジで加熱し、1.5 mLチューブの1 mLアリコートに分注します。</li>
	</ol></li>
</ol>2. ゼブラフィッシュの繁殖と胚採取
注:コミットされた骨芽細胞の存在を報告したダブルトランスジェニックゼブラフィッシュの幼生[osterix:nGFP = Tg(Ola.Sp7:NLS-GFP)zf132]29 およびマクロファージ[mpeg:mCherry = Tg(mpeg:mCherry)gl23]がここで使用されました30 （図1A)。
<ol><li>交配の前夜に、標準的な交配ケージに目的の単一導入遺伝子を持つ親ゼブラフィッシュをセットアップします。 注:標準的な交配ケージでは、卵は親のゼブラフィッシュが到達できない下部コンパートメントに渡すことができます。<ol><li>交配ケージの仕切りを使用して交尾するまで、オスとメスを分離しておきます。翌日の朝に仕切りを取り外して交配を開始します。</li>
	</ol></li>
	<li>遅くとも正午には、親ゼブラフィッシュを繁殖水槽から取り出し、胚を採取し、交尾ケージから水をふるいにかけます。 注:幼虫の正確な年齢が決定的な場合は、約30分の定期的な間隔で胚を収穫します。クラッチメイトは、さまざまな実験グループでの実験で使用する必要があります。</li>
	<li>胚を直径100 mmのディッシュに1x E3培地を入れ、28°C31のインキュベーターに保管します。</li>
	<li>実体顕微鏡の助けを借りてプラスチック製のピペットを使用して皿から未受精卵と死んだ胚を取り出し、毎日1x E3培地を交換します。</li>
	<li>実験の前に、レポーター導入遺伝子に陽性の幼虫を蛍光実体顕微鏡で選別します。</li>
</ol>3. 低融点アガロースへの幼虫の埋め込み
<ol><li>LMAアリコートをサーモブロックまたはウォーターバスで65°Cで溶かします。 LMAが溶けたら、埋め込むまで42°Cに保ちます(図1B)。溶かした1 mLのLMAアリコートに0.4% MS-222 50 μLを加えて、麻酔用のMS-222濃度を0.02%にします。</li>
	<li>4 dpf(受精後数日)の幼虫(またはそれ以上の幼虫)を0.02%MS-222 E3培地で麻酔します。</li>
	<li>麻酔をかけた幼虫を3mLのプラスチック製パスツールピペットを使用してガラス底のマイクロウェル皿に移し、同じピペットで余分なE3培地を取り除きます(図1B)。幼虫の乾燥を避けてください。 注:複数の幼虫を同時に皿に埋め込むことができます。配置に十分な時間を確保するために、3〜5匹の幼虫を埋め込むことをお勧めします。</li>
	<li>溶かしたLMAアガロースをウォーターバス/サーモブロックから取り出し、皿に(冷却)滴のLMAを加え、幼虫が配置されたガラス底を覆います。LMAは熱すぎず、まだ液体であることに注意してください。</li>
	<li>次に、アガロースが固まる前に、幼虫を目的の横方向の位置に置きます。ここでは、逆顕微鏡セットアップの準備として、オペルが皿のガラス底にできるだけ近づく横方向の位置を確保します(図1B)。</li>
	<li>アガロースを固化させてから、アガロースの乾燥を避けるために、E3培地(最大0.02%MS-222を含む)を皿に加えます(図1B)。</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67279/67279fig01.jpg"> 図1:包埋手順の概略図。 (A) ダブルトランスジェニックTg(osterix:nGFP;mpeg1:mCherry)29,30 ゼブラフィッシュの幼生で、緑色で標識された手術性骨芽細胞と赤色で標識されたマクロファージを使用しました。(B)プロトコルのステップ3に記載されている埋め込み手順のワークフロー。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67279/67279fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
4. 幼虫の in vivo イメージングとレーザーアブレーション
<ol><li>トランスジェニックゼブラフィッシュTg(osterix:nGFP;mpeg1:mCherry)29,30、25x/0.95水対物レンズまたは同等のセットアップを備えた倒立型2光子レーザー走査型顕微鏡を使用します。</li>
	<li>幼虫が埋め込まれた皿を倒立顕微鏡の顕微鏡ステージに置き、アブレーションの目的の領域を視野の中央に配置します。オペクルは、GFP蛍光シグナルの助けを借りて簡単に同定できます。</li>
	<li>オペクルが顕微鏡の視野の中心に集束し、中央に配置されたら、オペクルの全幅を画像化するために、zスタック設定(多くの場合、1〜2μmのz間隔が使用されます)を選択します。同時に、アブレーションする特定のz平面内の領域(通常はオペラクルの後部ゾーン)を選択します。2光子レーザーアブレーションは、この平面でのみ発揮されます。 注:z次元の解像度が高いほど、イメージング時間が長くなりますが、後で取得したデータの体積分析が可能になります。</li>
	<li>アブレーション前の眼窩の関心領域を画像化します。GFP検出には、488 nmの白色光レーザーと、495 nmから550 nmまたは同等のハイブリッド検出器を使用します。555 nm(白色光レーザー)励起を使用してマクロファージをイメージングし、ハイブリッド検出器(または同等のもの)で595〜780 nmのmCherry検出範囲を使用します。<ol><li>品質/時間比を良くするには、512 x 512の画像形式を使用します(高解像度または高速が必要な場合は、他の形式を使用できます)。 注:顕微鏡に設置された温度制御インキュベーターを使用して、たとえば28°Cに調整できます。</li>
	</ol></li>
	<li>選択した2D平面に直径25μm(実験に応じて他の形状やサイズも選択可能)の円形領域を描き、ROIツールを使用してオペルに焦点を合わせます。</li>
	<li>アブレーションを実行するには、450 mWでアブレーションパワー(目的なしで測定)を適用し、選択した領域を400 Hzのスキャン速度と合計10秒の持続時間で2光子レーザーにさらします。アブレーション中、401〜443 nmまたは同等の範囲のハイブリッド検出器を使用して領域を視覚化できます。</li>
	<li>アブレーション後、アブレーション前に使用したのと同じ設定で同じzスタックを再度イメージングすることにより、アブレーションを構造的に確認します。アブレーションされた領域には蛍光細胞が含まれなくなりました。</li>
</ol>5. 幼虫の回収と免疫細胞の動員を監視するためのイメージング
<ol><li>免疫細胞の動員のイメージングを遅らせて実行する必要がある場合は、イメージングと麻酔から幼虫を回収します。鉗子または解剖針を使用して、幼虫をLMAから慎重に取り出します。<ol><li>まず、幼虫を覆っているアガロースの層を取り除きます。次に、幼虫と直接接触しているアガロースを取り除きます。免疫細胞の動員の即時イメージングが行われている場合は、この手順を省略します。</li>
	</ol></li>
	<li>幼虫を純粋なE3培地を入れた皿に戻し、回復を確認します。回復は幼虫の泳ぎによって明らかです。</li>
	<li>4 hplまたは6 hpl(病変後数時間)で、同じ顕微鏡で同じ設定を使用してオペクル領域を再度画像化し、マクロファージの動員に対するアブレーションの影響を確認します。これを行うには、埋め込み(ステップ3)と前に実行したようにイメージング(ステップ4)を繰り返します。</li>
	<li>イメージング後、LMAから幼虫を取り出します。幼虫の犠牲化は、法的要件に応じて、氷水でのインキュベーションまたはE3でのMS-222の過剰投与によって行うことができます。その後、検体はフォローアップ研究に使用したり、廃棄したりできます。</li>
</ol>6. 画像解析・統計解析
<ol><li>Fiji32などの画像処理ソフトウェアを使用して画像を処理します。取得したデータのz解像度に応じて、2Dまたは3Dで解析を実行できます。</li>
	<li>マクロファージは、主要な細胞体を識別するなど、明確に分離している細胞を含めるか、核標識で細胞を定量するか、細胞が重なっている場合に面積を測定することにより、手動で定量化します(次のステップ)。</li>
	<li>領域を定量化するには、マクロファージを囲むマスクを作成します。これを行うには、 Image &gt; Adjust &gt; Threshold ツールを使用して、フィジーでROI(Analyze &gt; Tools &gt; ROI Manager &gt; Add)を作成します。背景の小さな粒子を定量化のために除外します。<ol><li>次に、面積を測定します(分析&gt;測定)。細胞蛍光が重なる領域を測定に含める必要があるかどうかを検討します。 注:ここでは、この領域では動員されたマクロファージを区別できないため、円形アブレーション領域は領域測定から省略されました。</li>
	</ol></li>
	<li>適切なソフトウェアを使用して測定結果をプロットしたグラフを生成します。アブレーションの前後でデータを比較するには、適切な統計的検定を実行します (ここでは、対応のある片側 t 検定 が実行されました)。 注:フィギュアは、写真編集およびグラフィックデザインソフトウェアを使用して作成できます。</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>ゼブラフィッシュ幼生の骨再生を研究するためのレーザーアブレーション法

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<li>O'Connor, J., Akbar, F. B., Hutson, M. S., Page-McCaw, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zones+of+cellular+damage+around+pulsed-laser+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Zones of cellular damage around pulsed-laser wounds.</a> PLoS One. 16 (9), e0253032(2021).</li>
<li>Griebel, M., Vasan, A., Chen, C., Eyckmans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+clearance+of+damaged+tissue+following+laser+ablation+in+engineered+microtissues%5BTitle%5D)+AND+%22APL+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Fibroblast clearance of damaged tissue following laser ablation in engineered microtissues.</a> APL Bioeng. 7 (1), 16112(2023).</li>
<li>Matrone, G., Taylor, J. M., Wilson, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-targeted+ablation+of+the+zebrafish+embryonic+ventricle%3A+a+novel+model+of+cardiac+injury+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Laser-targeted ablation of the zebrafish embryonic ventricle: a novel model of cardiac injury and repair.</a> Int J Cardiol. 168 (4), 3913-3919 (2013).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>塩化カルシウム二水和物、CaCl2&middot;H2O</td><td>Carl Roth</td><td>5239.1</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養皿、PS、100/20 mm</td><td>Greiner Bio-one</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 Foceps</td><td>FST</td><td>11295-51</td><td>先端形状 ストレート、11 cm、0.05 x 0.02 mm</td></tr><tr><td>Falcon 6 ウェルプレート</td><td>Corning</td><td>353502</td><td></td></tr><tr><td>ガラス底マイクロウェル皿</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>35 mm ディッシュ、No. 1.5 カバースリップ、ガラス径 14 mm、コーティングされていない</td></tr><tr><td>Insight X3 多光子レーザー</td><td>Spectra-Physics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica Application Suite</td><td>LAS X、ライカ マイクロシステムズ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>低融点アガロース&nbsp;</td><td>Biozyme</td><td>840101</td><td>Biozym Plaque Agarose</td></tr><tr><td>Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4&middot;7H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5921</td><td></td></tr><tr><td>嵌合ケージ</td><td></td><td></td><td>多くの品種、例えば、Tecniplast</td></tr><tr><td>Methyleneblue</td><td>Carl Roth</td><td>A514.1</td><td></td></tr><tr><td>MS-222</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム、KCl</td><td>PanReac AppliChem</td><td>131494</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム、NaCl</td><td>カールロス</td><td>3957.1</td><td></td></tr><tr><td>SP8 ファルコン&nbsp;</td><td>ライカマイクロシステム</td><td></td><td>Insight X3多光子レーザーとライカアプリケーションスイートソフトウェアを装備</td></tr><tr><td>ステンレススチール解剖ニードル</td><td>Bochem</td><td>12010</td><td>140 mm</td></tr><tr><td>実体顕微鏡システム SZX16</td><td>オリンパス</td><td></td><td>LED照明ベースを装備 SZX2-ILLTQ</td></tr><tr><td>サーモスタットキャビネット TS - WTW</td><td>木部</td><td>TS 608/2-i</td><td>インキュベーション(胚)用</td></tr><tr><td>トランスファーピペット、3.5 mL</td><td>SARSTEDT</td><td>861171</td><td>155 x 15 mm、LD-PE、透明</td></tr><tr><td>Zeiss SteREO Discovery.V12 バージョン 4.7.1.0。</td><td>Axiocam MRmカメラとAxioVisionソフトウェアを搭載した</td><td>Zeiss</td><td></td>社</tr></tbody></table>

ゼブラフィッシュ幼生の発育中の骨芽細胞の2光子レーザー媒介アブレーション

Two-Photon Laser-Mediated Ablation of Osteoblasts in Developing Zebrafish Larvae

レーザーアブレーションは、上記のプロトコルに示されているように実施されました。アブレーション領域の骨芽細胞のGFP信号は、アブレーション後すぐに消失した。骨芽細胞アブレーションの応答を免疫応答の観点から研究するために、6 dpl前と6 hplでの6 dpf幼虫のマクロファージの存在を画像化しました。アブレーション前は、オペラクル領域10 にマクロファージはほとんど観察されませんでした(図2)。6 hplでは、切除されたオペクル領域にマクロファージが強く蓄積し、オペクルとオペクルの周辺領域を含む視野内のマクロファージの数が増加したことが検出されました10 (図2)。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67279/67279fig02v2.jpg"> 図2:6 dpfゼブラフィッシュの幼生における6 hplでのマクロファージの動員。 アブレーションなしの手術領域と6 hpl。手術性骨芽細胞は緑色で、マクロファージはマゼンタでラベル付けされ、破線の円はレーザーアブレーションされた領域を示します。スケールバー:50μmこの <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67279/67279fig02large.jpg" target="_blank">図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
マクロファージの動員は、4 dpfの幼虫でも解析され、4 hplのオペルクルははるかに小さく、同様の結果が観察されました(図3)。マクロファージ数(即時レーザーアブレーション部位外)の定量化は、調査された時間枠内での増加を示しました(アブレーション前のマクロファージは4.00±2.37マクロファージ対4hplでは7.00±2.76マクロファージ)( 図3B)。同様に、マクロファージ面積(アブレーション前はμm2、785.8 μm2 ± 723.1 μm2 で測定 vs 4 hpl で 1553 μm2 ± 869.9 μm2 ) が増加しました(図 3C)。マクロファージは見分けがつかない場合があるため、ここで行ったように、マクロファージの数ではなくマクロファージの面積を測定することをお勧めします。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67279/67279fig03.jpg"> 図3:4 dpfゼブラフィッシュの幼生における4 hplでのマクロファージの動員。 (A)アブレーションなしおよび4 hplのオペクル領域。手術性骨芽細胞は緑色で、マクロファージはマゼンタでラベル付けされ、破線の円はレーザーアブレーションされた領域を示します。スケールバー:50μm.(B)アブレーションの直前(0hpl)とアブレーション後(4hpl)のオペラクル領域のマクロファージの数の定量化。(C)マクロファージ領域の定量化(レーザーアブレーションの部位は除く)。対応のある片側 t検定。各ドットは 1 匹の幼虫のデータを表し、SD ±の平均 n = 6 が示されています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67279/67279fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

Zebrafish (Danio rerio) have an outstanding capacity to regenerate different organs and appendages. Bone regeneration in zebrafish has been studied using ...

two-photon-laser-mediated-ablation-osteoblasts-developing-zebrafish

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

ここでは、長期的イメージング、二光子イメージングと組織損傷のテクニック、およびタイムラプス共焦点イメージングのためのゼブラフィッシュ胚を装着するための方法を説明します。...

ライブゼブラフィッシュの胚における二光子軸索切断とタイムラプス共焦点イメージング

ヒトの急性腎臓損傷（AKI）は腎臓のネフロンを構成する上皮細胞の損傷によって引き起こされる一般的な臨床上の問題であり、AKIは50から70パーセント1の高い死亡率に関連付けられています。この現象を導くメカニズムと限界がよくわかっていないままにかかわらず、上皮細胞の破壊に続いて、ネフロンは、再生する機能が制限されています。このビデオの記事では、我々はターゲットレーザーのゼブラフィッシュ胚の腎臓で腎臓のネフロン細胞の切除、または前腎のための私たちのテクニックを説明します。私たちの新しいメソッドは、AKIの腎毒性誘発性のモデルを補完し、腎臓のネフロンにおける上皮再生に関連付けられている細胞と分子の変化の高解像度の理解を得るために使用することができます。...

腎上皮再生を研究するためにゼブラフィッシュの前腎のレーザーアブレーション

ここで紹介する方法は、高エネルギーのレーザーパルスと時間でこれらの損傷とその回復のその後の分析でライブゼブラフィッシュ胚の正確な傷害を含む。我々はまた、遺伝的に単一標識又は骨格筋細胞のグループが中に、レーザー光誘起損傷後に追跡することができる方法を示しています。...

ゼブラフィッシュ胚骨格筋のレーザー招いた傷害

このビデオでは、2光子レーザー軸切開術を使用してゼブラフィッシュの胚の軸索を損傷し、損傷からの軸索の回復を観察する方法を説明しています。...

2光子レーザー軸索切開術:ゼブラフィッシュ胚の軸索を損傷し、軸索の回復を観察する方法

出典: Morsch, M.,  et.al., 従来のUVレーザー共焦点顕微鏡法による細胞ストレスと死のトリガー. J. Vis. Exp. (2017)...

共焦点顕微鏡を用いたゼブラフィッシュ幼生における選択的単一ニューロンレーザーアブレーション

出典:武藤、A.、他.ゼブラフィッシュ幼生におけるカルシウムイメージングと行動記録を用いた2光子レーザーを用いた神経集団のアブレーションとその評価 J. Vis. Exp. (2018) }このビデオでは、...

ゼブラフィッシュララバにおける2光子顕微鏡を用いた標的ニューロンアブレーション

ここでは、ゼブラフィッシュ幼虫からの 2 光子レーザーによる神経細胞の遺伝的標識個体をアブレーションするプロトコルを提案する.

二光子励起レーザーとゼブラフィッシュ幼虫におけるカルシウム イメージング法と行動記録を用いた評価を用いたニューロン集団のアブレーション

レーザーアブレーションは、生物系の再生を研究するための広く応用できる技術です。提示されたプロトコルは、ゼブラフィッシュ横線で神経間細胞を再生するレーザーアブレーションとその後のタイムラプスイメージングのための標準的なレーザー走査共焦点顕微鏡の使用を記述する。...

ゼブラフィッシュインターニューロマスト細胞における共焦点顕微鏡ベースレーザーアブレーションと再生アッセイ

胚発生には、細胞運動の大規模な調整が必要です。2光子励起媒レーザーアブレーションは、深部細胞の大群の空間制御3次元アブレーションを可能にする。さらに、この技術は、生体内で細胞を機械的環境 で...

ゼブラフィッシュガストラの2光子顕微鏡を用いた深部および空間制御体積アブレーション

私たちは、明視野ベースの立体顕微鏡を使用して、ゼブラフィッシュの幼生の尾びれの再生のダイナミクスを全組織スケールで捉えるためのプロトコルを提示します。この技術により、単一細胞の分解能で再生ダイナミクスを捉えることができます。この方法は、CCDカメラとタイムラプスソフトウェアを搭載したあらゆる実体顕微鏡に適用できます。...

タイムラプス明実体顕微鏡でゼブラフィッシュ幼虫における組織修復をキャプチャ

学ぶ ゼブラフィッシュ幼生の骨芽細胞を用いた2光子レーザーアブレーション法で、骨再生と免疫応答のメカニズムを解明します。この手法は再生医療研究に有用です。

ゼブラフィッシュ幼生の発育中の骨芽細胞の2光子レーザー媒介アブレーション

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