Name: ムール貝(Mytilus galloprovincialis)血球運動性に基づく毒物学的および生態毒性学的アッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-13T13:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: 学ぶ Mytilus galloprovincialisの血球運動性を用いた新規in vitro毒性評価法。タイムラプス顕微鏡で免疫細胞の動きを定量化し、環境汚染物質の生態毒性スクリーニングとリスク評価に応用する倫理的代替手法を確立する。

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<ol><li>Di Paolo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioassay+battery+interlaboratory+investigation+of+emerging+contaminants+in+spiked+water+extracts+-+Towards+the+implementation+of+bioanalytical+monitoring+tools+in+water+quality+assessment+and+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Bioassay battery interlaboratory investigation of emerging contaminants in spiked water extracts - Towards the implementation of bioanalytical monitoring tools in water quality assessment and monitoring.</a> Water Res. 104, 473-484 (2016).</li>
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<li>Connon, R. E., Geist, J., Werner, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect-based+tools+for+monitoring+and+predicting+the+ecotoxicological+effects+of+chemicals+in+the+aquatic+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors%22%5BJournal%5D)">Effect-based tools for monitoring and predicting the ecotoxicological effects of chemicals in the aquatic environment.</a> Sensors. 12 (9), 12741-12771 (2012).</li>
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<li>Pruzzo, C., Gallo, G., Canesi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence+of+vibrios+in+marine+bivalves%3A+The+role+of+interactions+with+hemolymph+components%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Persistence of vibrios in marine bivalves: The role of interactions with hemolymph components.</a> Environ Microbiol. 7 (5), 761-772 (2005).</li>
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<li>Furukawa, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemocyte+migration+and+expression+of+four+Sox+genes+during+wound+healing+in+Pacific+abalone%2C+Haliotis+discus+hannai%5BTitle%5D)+AND+%22Fish+Shellfish+Immunol%22%5BJournal%5D)">Hemocyte migration and expression of four Sox genes during wound healing in Pacific abalone, Haliotis discus hannai.</a> Fish Shellfish Immunol. 117, 24-35 (2021).</li>
<li>Lau, Y., Gambino, L., Santos, B., Espinosa, E., Allam, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+oyster+%28Crassostrea+virginica%29+hemocyte+motility+by+the+intracellular+parasite+Perkinsus+marinus%3A+A+possible+mechanism+for+host+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Fish+Shellfish+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regulation of oyster (Crassostrea virginica) hemocyte motility by the intracellular parasite Perkinsus marinus: A possible mechanism for host infection.</a> Fish Shellfish Immunol. 78, 18-25 (2018).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>0.2 &マイクロ;mフィルター(直径25mm)</td><td>ABLUO&nbsp;</td><td></td><td>実験器具</td></tr><tr><td>2.5 ml 皮下注射器 針 22G</td><td>光線</td><td>2522CM32</td><td>実験器具</td></tr><tr><td>96 ウェル平底ポリスチレン TC 処理マイクロプレート</td><td>コーニング</td><td>3916</td><td>実験器具</td></tr><tr><td>CaCl2.2H2O</td><td>Merk (Sigma - Aldrich)&nbsp;</td><td>C3881-1KG</td><td>ケミカル</td></tr><tr><td>ケモタキシスおよびマイグレーションツールソフトウェア&nbsp;</td><td>(Ibidi GmbH)</td><td></td><td>ソフトウェア</td></tr><tr><td>Cytation 5&nbsp;</td><td>Agilent BioTeck</td><td>Cytation 5</td><td>機器: 細胞イメージング マルチモード リーダー</td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド (DMSO)&nbsp;</td><td>メルク(シグマ-アルドリッチ)&nbsp;</td><td>472301</td><td>Solvent</td></tr><tr><td>Falcon 15 mL チューブ コニカルボトム</td><td>コーニング</td><td>352196</td><td>ラボウェア</td></tr><tr><td>H3BO3</td><td>Merk (Sigma - Aldrich)&nbsp;</td><td>B0394</td><td>化学</td></tr><tr><td>血球計算盤 高速読み取り 102</td><td>Biosigma</td><td>BVS100</td><td>実験器具</td></tr><tr><td>HEPES (4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジン-エタンスルホン酸)</td><td>Merk (Sigma - Aldrich)&nbsp;</td><td>H3375-500G</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>ImageJ software</td><td>NIH</td><td></td><td>software</td></tr><tr><td>KBr</td><td>Merk (Sigma - Aldrich)&nbsp;</td><td>P9881</td><td></td></tr><tr><td>ケミカルKCl</td><td>メルク&nbsp;</td><td>104936</td><td></td></tr><tr><td>化学 L-グルタミン</td><td>メルク (Sigma - Aldrich)&nbsp;</td><td>G7513</td><td>細胞培養培地用必須アミノ酸</td></tr><tr><td>MgCl2&middot;6H2O</td><td>Merk (Sigma - Aldrich)&nbsp;</td><td>M2670</td><td>化学</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Merk (Sigma - Aldrich)&nbsp;</td><td>M7506</td><td>化学</td></tr><tr><td>顕微鏡 ニコン エクリプス E600</td><td>ニコン</td><td></td><td>装置:細胞イメージング&nbsp;</td></tr><tr><td>Na2SO4</td><td>Riedel-de Haen</td><td>31481</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merk (Sigma - Aldrich)&nbsp;</td><td>31434-1KG-R</td><td>化学</td></tr><tr><td>NaF</td><td>フルーカ</td><td>71519 500g</td><td>化学</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Merk (Sigma - Aldrich)&nbsp;</td><td>S5761-1KG</td><td>ケミカル</td></tr><tr><td>ニュートラル レッド</td><td>メルク (Sigma - Aldrich)&nbsp;</td><td>N4638-1G</td><td>バイタルセル色素</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>メルク (Sigma - Aldrich)&nbsp;</td><td>P0781-100ML</td><td>細胞培養用抗生物質</td></tr><tr><td>SrCl2&middot;6H2O</td><td>Merk (Sigma - Aldrich)&nbsp;</td><td>255521</td><td>ケミカル</td></tr><tr><td>トリパンブルー&nbsp;</td><td>メルク(シグマ-アルドリッチ)&nbsp;</td><td>T8154</td><td>細胞色素</td></tr></tbody></table>

ムール貝(mytilus galloprovincialis)血球運動性に基づく毒物学的および生態毒性学的アッセイ

A Toxicological and Ecotoxicological Assay Based on Mussel (Mytilus galloprovincialis) Hemocytes Motility

この研究では、Mytilus galloprovincialis血液細胞の運動性を利用して、汚染物質の毒性と生態毒性を迅速かつ高感度に評価するための新しいin vitro法を紹介します。図1A-Cは、ウェルの底に30分間付着した後の血球の代表的なタイムラプスイメージングを示しています。図中の細胞は、運動性評価の直前にニュートラルレッドで染色されました。細胞の動きは、光学顕微鏡を用いて、10分間、20倍の倍率で、マルチモードリーダーを用いて、1分間、10分間モニターした。図 1A-C は、0 分、5 分、10 分で同じ関心領域 (ROI) からキャプチャされた 11 フレームのうち 3 フレームを示しています。3 つの図すべてに同じセルに番号が付けられ、その動きが強調され、その軌跡を明確に示すために、番号付けは図全体で一貫しています。
細胞は、ラメリポディア活性と迅速な形状変化に基づく単一細胞の動きを示します。細胞は、追跡中の視覚化を改善するために、バイタル色素であるニュートラルレッドで標識されました。ニュートラルレッドは、両親媒性で弱いカチオン性色素で、細胞膜に容易に浸透することができます。細胞内に入ると、色素はプロトン化によりリソソームに閉じ込められます。ムール貝の血球、特に顆粒球は、よく発達したリソソーム系を示します。したがって、それらはニュートラルレッド染色によってよく視覚化され、細胞質にはいくつかの赤色の標識リソソームが豊富に含まれており、核(色素によってマークされていない)は半透明の穴として現れます。
プロトコルの適用を通じて、2つの主要な血球の形態型は、Udayanら23に従って観察することができる:(1)双極ビーン形状および時にはアメーバ形状の広がり細胞、およびより小さな丸い星形細胞(細胞n = 3および10)。どちらの細胞型でも、運動は連続的な形状変化によって特徴付けられ、偽足と糸状足の継続的な伸縮が続きました。
このプロトコルアプリケーションにより、 図2で報告されているように軌道プロットを作成し、平均速度や直接性などの主要な速度パラメータを計算することにより、血球の運動性の評価を成功させることができます。これらは、ウェルの底に30分間付着した後の基礎生理学的条件下で、スプレッド細胞でそれぞれ6.46 ± 0.2 μm/minおよび0.56 ± 0.02(平均± SEM)、小細胞で5.18 ± 0.34 μm/minおよび0.37 ± 0.03に対応しました。したがって、このプロトコルでは、速度測定パラメータに基づいて異なる血球集団を分類することができます。
プロトコルの適用により、薬物または汚染物質への曝露後に血球運動速度パラメータの変化を検出することができます。図3A-Dは、世界中の河川で最高濃度と検出頻度で環境に放出された医薬品(PiE)の1つであるパラセタモールへのムール貝血球のin vitro曝露の代表的な結果を示しています31。
Udayanら23によれば、対照細胞では、両方の細胞形態型において経時的な速度の有意な増加が観察され、24時間培養中の血球の活性化を示唆しており、これはおそらく、培養環境での離脱およびプレーティングによって実験的に誘発された炎症反応を喚起するものである。細胞を薬物に曝露すると、24時間後に広がった細胞(図3A)では血球の運動性活性化が有意に減少したが、小さな丸い細胞(図3C)では減少しなかった(時間0で評価された)平均基底速度が低いことを特徴としていた。さらに、このプロトコルは、24時間後の小細胞の直接性の有意な増加および拡散細胞における1時間曝露後の直接性の減少によって示されるように、薬物曝露後の細胞軌道変化の検出を可能にした(図3C、D)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67285/67285fig01.jpg"> 
図1:ウェルの底に付着してから30分後の中性赤く染色された血球の代表的なタイムラプスイメージング。 細胞は、運動性評価の直前にバイタル色素Neutral Redで染色されました。細胞の動きを光学顕微鏡を用いて、1分に1枚の画像の割合で10分間、20倍の倍率でモニターした。簡潔にするために、パネル A、 B、 C には、同じ関心領域 (ROI) からキャプチャされた 11 フレームのうち 3 つが 0 分、5 分、10 分に表示されます。3つの図すべてに同じセルに番号が付けられており、動きを示すために矢印が時間間隔を示しています。スケールバーは100μmを表します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67285/67285fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67285/67285fig02.jpg"> 
図2: M. galloprovincialis 血球の代表的な軌跡プロット。 表示されている軌跡は、1 つのウェルから取得されます。25個のセルの軌跡が示されています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67285/67285fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67285/67285fig03v2.jpg"> 
図3:パラセタモール曝露(24時間)が、拡散細胞(A,B)および小さな丸い星型細胞(C,D)の速度および直接性に及ぼす影響。 データはSEM±平均で表されます。データの統計的有意性は、一元配置ANOVAとテューキーの事後検定によって評価されました。*p &lt; 0.05 対制御 (p &lt; 0.05)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67285/67285fig03largev2.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

ムール貝(Mytilus galloprovincialis)血球運動性に基づく毒物学的および生態毒性学的アッセイ

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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