Name: フィーダーフリー条件下で培養したヒト多能性幹細胞におけるCRISPR-Cas9媒介遺伝子欠失 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-01T14:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 21 s
Description: 学ぼう、CRISPR-Cas9を用いたヒト胚性幹細胞H9のL2HGDH遺伝子欠失法。レンチウイルス導入系により多能性と分化能を保持したまま、安定した遺伝子ノックアウトを達成する手法です。

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<ol><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>2-メルカプトエタノール&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>31350010</td><td></td></tr><tr><td>38.5 mL、滅菌済み + 認定フリー オープントップ 薄壁超透明チューブ</td><td>ベックマン・コールター</td><td>C14292</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>幹細胞技術</td><td>7920</td><td></td></tr><tr><td>bFGF 組換えヒト</td><td>Invitrogen</td><td>PHG0261</td><td></td></tr><tr><td>Brachyury Rabbit mAb</td><td>Abclonal</td><td>A5078</td><td></td></tr><tr><td>BsmBI-v2</td><td>NEB</td><td>R0739S</td><td></td></tr><tr><td>chir99021</td><td>Tocris</td><td>4423/10</td><td></td></tr><tr><td>Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV-free</td><td>Corning</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>Cyclopamine</td><td>Stem cell technologies</td><td>72074</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 培地</td><td>Invitrogen</td><td>11995073</td><td></td></tr><tr><td>DMEM NUTRIENT MIX F12&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>DPBS w/o: Ca and Mg</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-36500</td><td></td></tr><tr><td>胎児 bovie 血清</td><td>Invitrogen</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>FoxA2/HNF3&beta;&nbsp;</td><td>CST</td><td>8186</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH (14C10) Rabbit mAb 抗体</td><td>CST</td><td>2118S</td><td></td></tr><tr><td>Gentle Cell Dissociation Reagent</td><td>Stem cell technologies</td><td>7174</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Non Essential Amino Acids (NEAA) 100x Solution</td><td>GE healthcare</td><td>SH30238.01</td><td></td></tr><tr><td>Ki-67 (D3B5) Rabbit mAb</td><td>CST</td><td>9129</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td>Invitrogen</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>L GLUTAMINE, 100x</td><td>Invitrogen</td><td>2924190090</td><td></td></tr><tr><td>L2H-BMSBSP-F1</td><td>Macrogen</td><td></td><td>CGTGCGGGTTCGCGTCTGGG</td></tr><tr><td>L2HGDH ポリクローナル抗体</td><td>Proteintech</td><td>15707-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>L2HGDH-SgRNA1-F</td><td>Macrogen</td><td></td><td>CACCGCGTGCGG GTTCGCGTCTGGG</td></tr><tr><td>L2HGDH-SgRNA1-R</td><td>Macrogen</td><td></td><td>AAACCCCAGACGC GAACCCGCACGC</td></tr><tr><td>L2HGDH-SgRNA2-F</td><td>マクロゲン</td><td></td><td>CACCGCCCGCGG GCTTTTCGCCGG</td></tr><tr><td>L2HGDH-SgRNA2-R</td><td>マクロゲン</td><td></td><td>AAACCCGGCGAA AAGCCCGCGGGC</td></tr><tr><td>L2H-SeqF1</td><td>マクロゲン</td><td></td><td>GCTAAAGAGCGC GGGTCCTCGG</td></tr><tr><td>L2H-SeqR1</td><td>マクロゲン</td><td></td><td>GTGGACGGGTTG TTCAAAGCCAGAG</td></tr><tr><td>L2H-UMSBSP-R1</td><td>Macrogen</td><td></td><td>GTGGACGGGTTG TTCAAAGCCAGAG</td></tr><tr><td>LentiCRISPRv2</td><td>Addgene</td><td>52961</td><td></td></tr><tr><td>mTesR1 完全培地</td><td>幹細胞技術</td><td>85850</td><td></td></tr><tr><td>Nanog 抗体</td><td>CST</td><td>3580</td><td></td></tr><tr><td>NEUROBASAL MEDIUM 1x CTS</td><td>Invitrogen</td><td>A1371201</td><td></td></tr><tr><td>Neuropan 2サプリメント 100x</td><td>PAN Biotech</td><td>P07-11050</td><td></td></tr><tr><td>Neuropan 27 サプリメント 50x</td><td>PAN Biotech</td><td>P07-07200</td><td></td></tr><tr><td>Oct-4 抗体</td><td>CST</td><td>2750</td><td></td></tr><tr><td>Pax6 (D3A9V) XP ウサギ mAb</td><td>CST</td><td>60433</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン ストレプトマイシン ゾル</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>ポリブレン感染試薬</td><td>Sigma</td><td>TR1003- G</td><td></td></tr><tr><td>ポリエチレン、分岐</td><td>Sigma</td><td>408727</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2.0</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>ピューロマイシン</td><td>Invitrogen</td><td>A1113802</td><td></td></tr><tr><td>qPCR レンチウイルス力価キット</td><td>Abm</td><td>LV900</td><td></td></tr><tr><td>岩石阻害剤 Y-27632 二塩酸塩&nbsp;</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td></td></tr><tr><td>SB 431542</td><td>Tocris</td><td>1614/10</td><td></td></tr><tr><td>Sox2</td>抗体 <td>CST</td><td>2748</td><td></td></tr><tr><td>スクロース</td><td>シグマ</td><td>57-50-1</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン .05% EDTA&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>U6-459F</td><td>Macrogen</td><td></td><td>GAGGGCCTATT TCCCATGATTC</td></tr><tr><td>Wizard Genomic DNA Purification Kit&nbsp;</td><td>プロメガ</td><td>A1120</td><td></td></tr><tr><td>XAV 939</td><td>トクリス</td><td>3748/10</td><td></td></tr></tbody></table>

フィーダーフリー条件下で培養したヒト多能性幹細胞におけるcrispr-cas9媒介遺伝子欠失

CRISPR-Cas9 Mediated Gene Deletion in Human Pluripotent Stem Cells Cultured Under Feeder-Free Conditions

lentiCRISPRv2ピューロにおけるL2HGDH sgRNAのクローニング lentiCRISPRv2ピューロベクターを市販で入手し( 「Table of Materials」を参照)、BsmB1で消化した結果、1.8 Kbのスタッファーフラグメントが放出されました。 図2Aに示すように、ベクターの完全な消化が観察されました。各コンストラクトについて、リバースsgRNA配列をプライマーとして、およびベクター配列内からのフォワードプライマー(U6-459F)を用いて、6つのクローンをインサートの有無についてスクリーニングした。このアプローチを使用すると、 図2Bに示すように、インサートを有するクローンのみが288 bpのPCR産物を生じ、sgRNAの逆配列を含まない陰性クローンはPCR産物を得られませんでした。
H9感染、安定選択、ウェスタンブロット hESCは、 L2HGDH 遺伝子のエクソン1を標的とする2つの異なるsgRNAを発現するレンチウイルス粒子に感染し、ピューロマイシンで選択されました。ウェスタンブロット解析は、安定して共発現するsgRNA細胞とCas9細胞の不均一集団から実施され、使用された2つのsgRNAのうちどちらが遺伝子欠失の誘導においてより効率的であるかを立証しました。 図3Aに示すように、 L2HGDH-sgRNA-1は、不均一な細胞集団におけるL2HGDHの発現を減少させるのに、他の配列よりも効率的でした。
クローン選択、増殖、タンパク質解析 L2HGDH-sgRNA-1を発現する細胞について、シングルセル選択とクローン増殖を行った。単一のクローンを産出したウェルをマークし、コロニーがさらに拡大し、凍結保存し、分析するのに十分なサイズ(通常は2週間)に達するまで成長させました(図3B)。ウェスタンブロット分析を使用して合計22個のクローンを解析したところ、L2HGDHに対して5つのホモ接合型ノックアウト(23%)が得られました。この結果は、レンチビラール媒介遺伝子導入を用いた遺伝子ノックアウトにより、1つのカセットからsgRNAとCas9の両方が安定的に共発現する高い効率性を示しています。図4は、5つのホモ接合型ノックアウトクローンとコントロール細胞のウェスタンブロット解析を示しており、選択したクローンでは、コントロールと比較して発現が100%減少していることが示されています。
DNAレベルでの解析 Cas9のPAM認識配列の上流にあるCRISPR変異部位をマッピングするために、コントロール細胞と5つの異なるクローンのゲノムDNAを用いて、Mutation Sites Based Specific Primers Polymerase Chain Reaction(MS-BSP PCR)を行いました。 図5に示すように、2つのクローン(A5およびB4)はPAM認識配列のすぐ近くに変異を持っていますが、他の3つのクローン(A1、A9、およびB12)は、変異がPAM部位にあまり近くなく、 L2HGDH 遺伝子のエクソン1内の20bp sgRNA配列のさらに上流にある可能性があることを示しました。
DNAの正確な突然変異を見つけるために、コントロール細胞(ベクターのみに感染したH9)からの精製PCR産物、および3つの異なるCRISPRクローン、A5、A1、およびB4をサンガーシーケンシングにかけ、PAMサイト8の上流にマルチプルアライメントツールclustalwを使用して突然変異部位をマッピングした。その結果、PAM部位の上流のA5クローンに欠失変異が明らかになりました。他の2つのクローン、A1およびB4は、 図6で強調表示されているように、PAM部位の上流に挿入変異を示しました。
クローンの機能解析 hESCでCRISPRノックアウト細胞株を作製したら、次のステップは、その多能性と分化能を確認することです。そのために、A1、A5、B4の3種類のクローンについて異なる多能性マーカーを試験し、その結果を対照細胞(ベクターのみの感染H9)細胞と比較しました。その結果、OCT4、NANOG、およびSOX2マーカーの免疫染色によって決定されたノックアウト細胞株の多能性電位に変化は見られませんでした。次に、コントロール細胞株とノックアウト細胞株を細胞増殖マーカーKI67についても染色しましたが、これもコントロールと比較してノックアウト細胞株に変化が見られませんでした。これらの結果は、CRISPRノックアウトがこれらの細胞の自己再生特性に影響を与えなかったことを示しています。また、EBやコロニー形成も影響を受けませんでした(図7)。当研究室で確立した in vitro 法を用いて、PAX6(神経外胚葉マーカー)、Brachyury(中胚葉マーカー)、FOXA2(内胚葉マーカー)の免疫染色により、すべてのクローンを3つの生殖細胞に分化させることに成功しました。ノックアウト細胞株の分化能に変化は対照細胞と比較して観察されず、ノックアウト細胞が分化能を保持していることが示されました(図8)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67296/67296fig01.jpg"> 
図1:5つのステップでスタディデザインを示す概略図。 ステップ1:sgRNAの設計とBsmb1消化V2 CRISPRベクターへのクローニング。ステップ2:ポリフェクションを用いたHEK293T細胞への同時トランスフェクションによるsgRNAとパッケージングプラスミドを運ぶエントリーベクターを用いたレンチウイルス粒子の作製と、超遠心分離によるウイルス濃縮。ステップ3:MOIが10〜20のレンチウイルス粒子を使用したhESCの感染と、ピューロマイシンを使用した安定した細胞選択、続いてsgRNAの効率を確認するための不均一な細胞集団の分析。ステップ4:不均一集団で最大のノックダウンを示した細胞からの限定希釈法による単一細胞クローニングおよび単一クローンの選択。ステップ5:単一クローンの拡張とDNAレベルでの解析、タンパク質、およびクローンの幹細胞性と分化の可能性の機能解析。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67296/67296fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67296/67296fig02.jpg"> 
図2:lentiCRISPR V2.puroベクターにおけるsgRNAのクローニング。 (A)制限酵素BsmB1によるlentiCRISPR V2.puroベクターの消化。矢印は、ベクターの消化時に放出される1.8 Kbのスタッファーフラグメントを示しています。(B)L2HGDH sgRNAコンストラクト1および2の異なるクローンのコロニーPCR分析。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67296/67296fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67296/67296fig03.jpg"> 
図3:シングルセル選択を用いたウェスタンブロットとクローン増殖。 (A)安定して共発現するsgRNA(L2H-1およびL2H-2)およびCas9およびCas9の不均一集団の2つの異なる生物学的複製(S1およびS2)からのウェスタンブロット分析、およびコントロール(C)H9 hESC。(B) L2HGDH-sgRNA-1を安定的に発現するH9細胞の単一細胞選択とクローン増殖。矢印は、単一のクローンのみを示す96ウェルプレートのウェルを示しています。スケールバー = 100 μM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67296/67296fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67296/67296fig04.jpg"> 
図4:H9の異なるクローンからのウェスタンブロット分析 (A-C) 22クローンの全細胞ライセートからのウェスタンブロット分析では、L2HGDHに対して5つのホモ接合ノックアウト(23%)が得られました。(D)ウェスタンブロットを用いた異なる生物学的複製実験によるL2HGDHノックアウトの確認。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67296/67296fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67296/67296fig05.jpg"> 
図5:さまざまなH9クローンのMSBSP PCR解析。 (A)MSBSP PCR解析に用いた L2HGDH エクソン1の配列解析。(B)コントロールとH9 V2 L2HGDH KO Clone B4を用いたMSBSP PCR解析のためのアニーリング温度の最適化。96.8 では、コントロールにはバンドが表示されますが、B4 には矢印で示されているようにバンドは表示されません。(C)すべてのホモ接合KOクローンの解析により、エクソン1内の変異部位のマッピングが以下のものになりました。A1 = In/Del が PAM サイトの近くにない。A5 = In/Del PAM サイトに近い。A9 = In/Del PAM サイトにかなり近い。B4 = In/Del PAM サイトに非常に近い B12 = In/Del PAM サイトの近くにありません。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67296/67296fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67296/67296fig06.jpg"> 
図6:サンガーシーケンシングされたPCR産物と参照 L2HGDH エクソン1配列とのアラインメント。 A1、A5、B4由来のサンガーシーケンシングPCR産物、およびコントロール細胞のマルチアライメントを、NCBIデータベースからの L2HGDH の第1エクソン内の参照配列とともに行いました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67296/67296fig06large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67296/67296fig07.jpg"> 
図7:CRISPRノックアウト細胞株の機能特性評価 (A)細胞を免疫染色し、多能性マーカー(OCT4、NANOG、SOX2)、自己複製(KI67)、EB、およびコントロール感染H9 hESCに対するコロニー形成について調べた。スケールバー:100μM.(B)陽性(+ve)発現細胞の割合をDAPI染色と比較して計算した。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67296/67296fig07large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67296/67296fig08.jpg"> 
図8:CRISPRノックアウト細胞株の分化可能性。 PAX6(神経外胚葉)、Brachyury(中胚葉)、およびFOXA2(内胚葉)のマーカーを使用した、対照感染H9細胞に対するCRISPRノックアウト細胞株の分化能に関する機能的特性評価。スケールバー:100 μMこの <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67296/67296fig08large.jpg" target="_blank">図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>プロトコルステップ</td>
			<td>所要時間</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LentiCRISPRv2におけるsgRNAのクローニング</td>
			<td>4日間</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>レンチウイルスの産生と力価測定</td>
			<td>5日間</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hESC感染、安定した細胞選択、および増殖</td>
			<td>2週間</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>シングルセルクローンの選択と増殖</td>
			<td>2週間</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>クローンの機能解析</td>
			<td>2週間</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1:プロトコルのステップと必要な推定時間のタイムライン。

フィーダーフリー条件下で培養したヒト多能性幹細胞におけるCRISPR-Cas9媒介遺伝子欠失

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ヒト膵臓の開発にリネージュの決定要因を問い合わせるためのゲノム編集とhPSCsの指向性分化

これは修正の CRISPR/Cas9 ribonucleoproteins を用いた編集が続いてプロトコル記述フィーダー無料条件で人間の膵臓の細胞からフット プリント無料誘導多能性幹細胞 (Ips)...

効率的な生成および CRISPR Cas9 システムを用いた人間の膵臓細胞から Ips をフィーダー フリーの編集

高速のためのプロトコル マウスに CRISPR/Cas9 を介した遺伝子破壊とひと造血細胞はこの資料に記載されています。Cas9 sgRNA ribonucleoproteins は、sgRNAsの in vitro転写と商業 Cas9...

CRISPR/Cas9 によるマウスおよび人間の造血前駆細胞の高効率遺伝子破壊

タグ内因のプロトコル CRISPR/Cas9...

人間でタグ内因性のタンパク質誘導多能性幹細胞 CRISPR/Cas9 を使用して

このプロトコルは、ヒト多能性幹細胞におけるCRISPR-CAS9を用いて定義されたヘテロ接合性またはホモ接合ヌクレオチド変化の生成を容易にする方法を提供する。...

ヒト多能性幹細胞におけるCRISPR-CAS9を用いて定義されたゲノム修飾の生成

シームレスなゲノム編集によるヒト多能性幹細胞への点突然変異の導入

以下のプロトコルは、完全なノックアウト血清代替のフィーダーフリー培地（KSR -...

完全ノックアウト血清代替フィーダーを含まない培地を用いてヒトiPS細胞のフィーダーフリー適応、文化と継

学ぼう、CRISPR-Cas9を用いたヒト胚性幹細胞H9のL2HGDH遺伝子欠失法。レンチウイルス導入系により多能性と分化能を保持したまま、安定した遺伝子ノックアウトを達成する手法です。

フィーダーフリー条件下で培養したヒト多能性幹細胞におけるCRISPR-Cas9媒介遺伝子欠失

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