<em>In Vivo</em> Confocal Fluorescence Imaging of Neural Activity Induced by Sensory Stimulation in Partially Restrained Larval Zebrafish

Joseph B. Alzagatiti; Luis Salazar; Heidi Brown; Gabriel Rosas; Lama Adel Jaber; Jaime L. Minaya; Courtney Scaramella; Adam C. Roberts; David  L. Glanzman

doi:10.3791/67301

インビボ部分的に拘束されたゼブラフィッシュ幼魚における感覚刺激により誘発される神経活動...

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Neuroscience

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In Vivo Confocal Fluorescence Imaging of Neural Activity Induced by Sensory Stimulation in Partially Restrained Larval Zebrafish

インビボ部分的に拘束されたゼブラフィッシュ幼魚における感覚刺激により誘発される神経活動の共焦点蛍光イメージング

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05:12 min

April 18, 2025

DOI: 10.3791/67301-v

Joseph B. Alzagatiti^1,2, Luis Salazar³, Heidi Brown³, Gabriel Rosas³, Lama Adel Jaber³, Jaime L. Minaya³, Courtney Scaramella⁴, Adam C. Roberts³, David L. Glanzman^2,5,6

¹Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology,University of California, Santa Barbara, ²Department of Integrative Biology and Physiology,University of California, Los Angeles, ³Department of Psychology,California State University at Fullerton, ⁴Department of Neuroscience,University of California, Riverside, ⁵Department of Neurobiology,David Geffen School of Medicine at UCLA, ⁶Integrative Center for Learning and Memory, Brain Research Institute,David Geffen School of Medicine at UCLA

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Overview

This study presents a detailed protocol for examining neural activity in brain regions of transgenic zebrafish expressing GCaMP calcium indicators using confocal microscopy. It aims to investigate dynamic changes in neural activity in response to stimulation, particularly focusing on fluorescence intensity in specific regions.

Key Study Components

Area of Science

Neuroscience
Neuroimaging
Transgenic models

Background

Transgenic zebrafish models allow for real-time imaging of neuronal activity.
GCaMP indicators provide a method for monitoring calcium fluctuations as a proxy for neural activity.
Confocal microscopy offers high spatial resolution to observe fluorescence intensity changes in neurons.
The protocol allows for precise control of imaging conditions to optimize data acquisition.

Purpose of Study

To develop a robust methodology for assessing GCaMP-mediated neural activity.
To characterize the time-lapse imaging responses in specific neuronal clusters of zebrafish.
To investigate the effects of certain stimuli on neural activity dynamics.

Methods Used

Confocal microscopy was used to visualize neuronal activity in vivo.
Transgenic zebrafish larvae aged 2–7 days post fertilization served as the biological model.
Laid out critical steps for acclimatization and imaging settings.
Included post-imaging analysis using Fiji software for assessing fluorescence intensity.

Main Results

The application of aloe isothiocyanate resulted in increased GCaMP fluorescence, indicating heightened neural activity.
Changes in imaging speed affected spatial and temporal resolution of neuronal visualization.
Normalized fluorescence intensity measurements facilitated the generation of neural traces over time.
Neurons in the hindbrain and spinal cord displayed significant activity changes in response to stimulus.

Conclusions

This study establishes a valuable imaging protocol for analyzing neural dynamics in zebrafish.
Findings enhance understanding of the relationship between stimuli and neuronal behavior.
Insights contribute to the broader comprehension of neural mechanisms and plasticity.

Frequently Asked Questions

What advantages does the zebrafish model offer?

The zebrafish model provides a transparent organism with rapid development, allowing for real-time imaging of neural activity in a living system.

How are the larvae prepared for imaging?

Larvae are embedded in low melting point agarose and positioned dorsal side up in embryo medium before imaging.

What types of data can be obtained?

Data includes time-lapse fluorescence imaging revealing changes in calcium dynamics associated with neuronal activity.

How can the method be adapted for other studies?

The protocol can be modified for various stimuli or fluorescent reporters to investigate different aspects of neural function.

What are some limitations of this technique?

Potential limitations include variations in zebrafish genetics and the challenge of capturing very fast neural activity due to resolution constraints.

ここでは、共焦点顕微鏡を用いて、GCaMPカルシウム指標を発現するトランスジェニックゼブラフィッシュの脳領域における神経活動を調べるための詳細なプロトコルを紹介します。

[講師]まず、胚培地で3%の低融点アグロスを準備し、アグロを損傷を与えることなくゼブラフィッシュを操作するのに安全な温度まで加熱します。アグロが冷えて固まる前に、受精後2〜7日の幼虫をガラス底のシャーレに背側を上にして配置します。幼虫が所定の位置でアグロが固まったら、5ミリリットルの胚培地を皿に加えます。メスを使用して、必要に応じて幼虫の周りのアグロを切ります。ゼブラフィッシュの入ったシャーレを共焦点顕微鏡のステージに移します。20分間順応した後、明視野イメージングを使用して、室温で40倍の水浸対物レンズの下に魚を中央に配置します。共焦点顕微鏡の取得パラメータは、蛍光分子の品質と発現レベル、および組織の深さと光学特性に基づいて設定します。レーザー出力とマスターゲイン設定を調整して、蛍光灯を最適な範囲で適切に捉え、Gキャンプの成功に依存する蛍光の不必要な損失を防ぎます。次に、脊髄の吻側部分に抱きついたニューロンクラスターの視野を中央に配置します。79.86 平方マイクロメートルの視野で、1.20 フレーム/秒のフレームレートで、ピクセルあたり 0.119 平方マイクロメートルの空間分解能で時系列スキャンを実行します。実験の目的に基づいて視野、サイズ、取得速度を調整します。イメージングの開始から2分後、41.67マイクロリットルのアロエイソチオシアネートストック溶液または胚培地を皿に加え、約30秒間記録を続けて、タイムラプスイメージングを通じて関心領域におけるG Camp 6の活性の変化を観察します。記録された出力がドットTIFファイル形式でない場合は、下流のフィジー分析のために、顕微鏡ソフトウェアスイートから画像ファイルをドットTIFファイルとしてエクスポートします。ニューラルトレース分析用のフィジーソフトウェアをダウンロードした後、フィジーを開き、ドットCZIファイルをプログラムにインポートします。フィジーの円またはフリーハンドツールを使用して、それぞれのアイコンをクリックして、関心のある領域またはニューロンを強調表示します。対象地域または ROI を選択したら、フィジーツールバーから [解析]、[ツール]、[ROI マネージャー] をクリックします。[Add T] をクリックして、選択した ROI を [ROI マネージャー] ウィンドウに追加します。ROI マネージャーで、[その他] と [複数メジャー] をクリックして ROI を分析します。設定をデフォルトのままにして、[OK] をクリックして生データを生成します。次に、出力を CSV ファイルとして保存し、Python またはスプレッドシートを使用してさらに操作できるようにします。次に、生データを正規化して、2分間のプレ刺激の最後の30秒を平均してニューラルトレースとして表し、指定された式を使用して正規化された蛍光強度を生成し、正規化されたデータをニューラルトレースとしてプロットします。アロエイソチオシアネートの投与は、幼虫ゼブラフィッシュの局所的な脳領域内でG CAMP 6S蛍光の増加を引き起こし、神経活動の亢進を示しています。毎秒0.10フレームの遅いキャプチャ速度で、後脳と脊髄のニューロンが高解像度ではっきりと見えました。キャプチャ速度を毎秒 0.79 フレームに上げると、空間分解能はわずかに低下しましたが、時間分解能は向上しました。毎秒3.16フレームでは、ニューロンはあまり明確に見えませんでしたが、より多くの時間的ダイナミクスを捉えました。

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神経科学第218号