従属栄養酵母と光合成糖分泌シアノバクテリアを組み合わせた共培養物の組み立てと定量化

私たちの研究は、スクロース分泌シアノバクテリアと従属栄養菌が関与する合成コンソーシアムにおける微生物ネットワークを理解することを目的としています。以前は、微生物学者は通常、単一の微生物の純粋な培養を研究していました。しかし、自然界では、微生物は通常コンソーシアムで発生するため、混合培養における微生物のネットワークも理解することが不可欠です。

大きな課題の1つは、すべてのコンソーシアムメンバーの成長を可能にする培地を含む、適切な成長条件を見つけることです。ここでは主に、従属栄養メンバーの成長の基礎を提供する光栄養メンバーによる最高のショ糖産生と分泌の最適化に焦点を当てています。無菌培養での成長を追跡するために、光学密度や後方散乱測定などの一般的な手法を使用できます。

ただし、これらの手法は、個々の種の細胞数が必要な共培養には適用されません。私たちのプロトコールでは、蛍光標識と細胞計数の組み合わせを適用して、異なる共培養パートナーを区別します。さらに、シンプルで低コストの方法から高価で高スループットの方法まで、さまざまな方法で同様の結果を達成できることを示すことができます。

まず、培養液を3日間培養した後、シアノバクテリア細胞をペレット化します。ペレットを25ミリリットルの滅菌CoYBG-11培地に再懸濁します。サンプルを4, 000gで室温で20分間遠心分離します。

次に、デカンテーションして上清を捨てます。光学濃度が決定されたら、無菌条件下で250ミリリットルのバッフルフラスコに計算された量のCoYBG-11を追加します。その後、計算された量のシアノバクテリアおよび従属栄養細胞懸濁液を添加して、最終培養量を50ミリリットルにします。

50ミリリットルの培養には、1モルのIPTGストックから50マイクロリットルを使用します。次に、フラスコをフォトインキュベーターに約200マイクロモルの光子/平方メートル/秒で置きます。摂氏30度で2%の二酸化炭素、150RPMで軌道振とう、および75%の湿度で環境を補います。

サンプリングのために、インキュベーターからフラスコを取り出し、無菌条件下で培養物から1ミリリットルのサンプルを採取します。顕微鏡による定量に備えるために、計数チャンバーとカバーガラスにほこりや細胞がないことを確認してください。カバーガラスを2つのサポートバーにスライドさせて、破損を防ぎながら少し力を入れて正しく配置します。

カバーガラスを適切に配置したら、カバーガラスが滑らないようにしながら、2つのガラス表面の間のニュートンリングを観察します。次に、細胞懸濁液を完全に混合し、チャンバーの端に数マイクロリットルを塗布します。チャンバーが毛細管の力で完全に満たされるようにします。

次に、光学顕微鏡の適切な対物レンズを使用し、計数チャンバーのグリッド線に焦点を合わせます。指定されたセルサイズに適した正方形のセルを数えます。粒子計数による定量化では、サンプルの光学濃度を0.1に調整します。

次に、10マイクロリットルのサンプルを10ミリリットルの等張測定バッファーに加えます。サンプルカップの蓋を固定し、カップを少し傾けてサンプルを優しく混合します。サンプルカップをパーティクルカウンターに置いた後、利用する細胞に適した細孔径のキャピラリーをサンプルカップに挿入し、機械のドアを閉めます。

測定を開始し、適切な範囲で記録します。この段階では、セルサイズが異なるセルを識別できます。シングルセルフローサイトメトリーによる定量では、サンプルの光学濃度を調整して、サイトメトリー測定に適した位置に配置してください。

所定の式を適用して、セル数が毎分10マイクロリットルの流量で毎秒1, 000〜10, 000セルの範囲内に留まるようにします。各サンプル細胞懸濁液の300マイクロリットルを96ウェルプレートの個々のウェルに移します。次に、96ウェルプレートをサイトメーターの自動サンプルに移します。

サンプルに関連する蛍光チャネルと散乱チャネルのドットプロットとヒストグラムを開きます。細胞濃度を決定するには、レコード機能を使用して定義されたサンプル量を記録します。APC-Hチャネルのヒストグラムを使用して、光栄養生物の赤色自家蛍光に基づいて、光生物と従属栄養生物のシグナルを分離します。

次に、従属栄養集団のみを表示するFITC-Hチャネルのヒストグラムを使用して、緑色蛍光タンパク質を含む従属栄養細胞を同定します。PC5.5-Hチャンネルのヒストグラムを使用して、赤色蛍光タンパク質を含む従属栄養細胞と赤色蛍光タンパク質を含まない細胞を区別します。