Name: 従属栄養酵母と光合成糖分泌シアノバクテリアを組み合わせた共培養物の組み立てと定量化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-27T13:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 44 s
Description: 学ぶ 光合成シアノバクテリアと従属栄養酵母の共培養システムの組み立てと定量化手法。蛍光標識、粒子計数、フローサイトメトリーによる個別種の追跡と微生物ネットワーク解析に役立つ。

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<meta charset="utf8"></head><body>スクロース分泌シアノバクテリアと真菌パートナーとの共培養のためのプロトコール

<table><tbody><tr><td>10x Ph1対物レンズ</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>46 04 01-9904</td><td></td></tr><tr><td>525/40 nm バンドパスフィルター</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>A01-1-0051</td><td>FITCフィルター(488nmレーザー内)</td></tr><tr><td>660/10nmバンドパスフィルター</td><td>ベックマン・コールター</td><td>A01-1-0055</td><td>APCチャネル(638 nmレーザー内)</td></tr><tr><td>710/50 nm バンドパスフィルター</td><td>ベックマン・コールター</td><td>B71092</td><td>PC5.5チャネル(561 nmレーザ)</td></tr><tr><td>Multisizer 4e</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td>用アキュベット<td>A35473</td><td>蓋付きサンプルカップ</td></tr><tr><td>アパーチャチューブ 30 &mu;マルチサイザー4eベ</td><td>ックマンコールター株式会社</td>用M<td>C92760</td><td>キャピラリー</td></tr><tr><td>オートクレーブ</td><td>ラボアソシエイツ</td><td>EQM-ARBP</td><td>材料の滅菌用</td></tr>バ<tr><td>ッフルフラスコROTILABO&reg;、ストレートネック、250ミリリットル</td>カール<td>ロスGmbH + Co. KG</td><td>LY95.1</td><td></td></tr><tr><td>BG11 / CoYBG11コンポーネント</td><td>異なるサプライヤー</td><td></td><td>表1&nbspを参照してください。</td></tr><tr><td>ボトルトップ滅菌</td><td>フィルターSigmaaldrich</td>は<td>、</td><td>オートクレーブ</td></tr><tr><td>キャピラリー45&マイクロを使用したくない場合は、滅菌培地にZ222593します。m</td><td>オムニ ライフサイエンス</td><td>OLS 5651738</td><td></td></tr><tr><td>CASY セルカウンター モデル TTC</td><td>Schaerfe Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CASY カップ</td><td>オムニ ライフサイエンス</td><td>OLS 5651794</td><td></td></tr><tr><td>CASYclean</td><td>オムニ ライフサイエンス</td><td>OLS 5651786</td><td>洗浄液</td></tr><tr><td>CASYton ソリューション</td><td>オムニ ライフサイエンス</td><td>OLS</td><td>5651808 アイソトニック ソリューション&nbsp;</td></tr><tr><td>遠心分離管(50 mL)</td><td>Sigmaaldrich</td><td>CLS430828</td><td></td></tr><tr><td>CO2</td><td>BOC</td><td>270182-L</td><td>シアノバクテリア無菌培養および共培養</td></tr>を供給する <tr><td>CONTRAD&reg; 70</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>81911</td><td>ディープ クリーン ソリューション</td></tr><tr><td>カバー ガラス 20 &times; 26 x 0.4 mm</td><td>VWR International GmbH</td><td>631-1190</td><td>計数室用カバー</td></tr><tr><td>ガラス キュベット</td><td>Sarstedt&nbsp;</td><td>67.742</td><td></td></tr><tr><td>シアノバクテリア BG-11 淡水溶液</td><td>Merck KGaA</td><td>C3061</td><td></td></tr><tr><td>CytExpert Software v. 2.6</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td></td><td>サイトメーターアプリケーションソフトウェア</td></tr><tr><td>CytoFLEX Sheath Fluid</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>B51503</td><td>Sheat fluid</td></tr><tr><td>Cytometer CytoFLEX S</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BE51180 DxH クリーナー マルチサイザー 4e</td><td>ベックマン・コールター用</td><td>628022</td><td>洗浄液</td></tr><tr><td>エッペンドルフチューブ遠心分離機 (小)</td><td>Labstac</td><td>CEN16-15</td><td>2mL未満の培養</td></tr>物 <tr><td>Ethanol</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>K928.1</td><td></td></tr><tr><td>FACS tubes</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>半自動モード用</td><td>2523749</td>チューブ</tr><tr><td>フロークリーン洗浄剤 500ml</td><td>ベックマン・コールター</td><td>C48093</td><td>毎日のクリーンソリューション</td></tr><tr><td>メディアの準備のための</td><td>メスシリンダー</td><td>Sigmaaldrich</td><td>Z131121</td></tr><tr><td>HEPPSO</td><td>Merck KGaA</td><td>R426725</td><td></td></tr><tr><td>Infors MultiTron photoincubator</td><td>Infors AG</td><td></td><td>白色 LED ライト</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Merck KGaA</td><td>I6758</td><td>アリコートを準備し、-20°Cで保存します。C、解凍して氷の上に保ちます&nbsp;</td></tr><tr><td>アイソトンII マルチサイザー4e用</td><td>ベックマン・コールター社</td><td>8448011</td><td>アイソトニックソリューション&nbsp;</td></tr><tr><td>Kaluza v. 2.2</td><td>ベックマン・コールター社</td><td>B16406</td><td>サイトメトリーデータ解析ソフトウェア</td></tr><tr><td>KimWipes</td><td>VWR International GmbH</td><td>115-2221</td><td>糸くずの出ない組織</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Merck KGaA</td><td>221473 KPO</td><td></td></tr><tr><td>3</td><td>Noah Chemicals</td><td>7790-53-6</td><td></td></tr><tr><td>測定ビーカー</td><td>VWR</td><td>213-3747</td><td></td></tr><tr><td>マイクロテストプレート、96ウェル、スリップオンリッド、フラットベース、PS、透明</td><td>SARSTEDT AG & Co. KG</td><td>82.1581.001</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡ベース</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>47 09 18-9902/16</td><td></td></tr><tr><td>Microsope ヘッド</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>47 30 14</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q 浄水システム</td><td>Merck Millipore</td><td>C85358</td><td></td></tr><tr><td>Mulitisizer 4e パーティクルカウンター</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>B23005</td><td>CASYセルカウンターの代替品</td></tr><tr><td>ノイバウアー改良、深さ0.02 mm</td><td>アシストドイツ</td><td></td><td>カウンティングチャンバー</td></tr><tr><td>ノイバウアー改良、深さ0.1 mm</td><td>Paul Marienfeld GmbH & Co. KG</td><td>640010</td><td>カウンティングチャンバー</td></tr><tr><td>レディ・トゥ・ユース デイリーQC フルオロスフィア</td><td>ベックマン・コールター社</td><td>C65719</td><td>QC</td></tr><tr><td>SCHOTTボトル</td><td>Dutscher</td><td>90347</td>の<td>保管</td></tr><tr><td>用リファレンスSpecord&reg;200プラス分光光度計</td><td>分析イエナGmbH</td><td></td><td>OD600/750</td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>メルクKGaA</td><td>84100</td><td></td></tr><tr><td>テーブルトップ遠心分離機(大)</td><td>Labstac</td><td>CEN18-06R</td>は<td></td></tr><tr><td>、アミノ酸なしで、硫酸アンモニウムなしで</td>、培養バイオマス酵母窒素塩基を収集します <td>サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社</td><td></td><td></td>11743014</tr></tbody></table>

従属栄養酵母と光合成糖分泌シアノバクテリアを組み合わせた共培養物の組み立てと定量化

Assembly and Quantification of Co-Cultures Combining Heterotrophic Yeast with Phototrophic Sugar-Secreting Cyanobacteria

光合成 性S. elongatus と従属栄養酵母の共培養の確立 Synechococcus elongatus PCC 7942とS. cerevisiaeのさまざまな亜系統との共培養からの詳細な結果を以前に報告しました。このシアノバクテリア/酵母のペアとの共培養結果の包括的な説明については、8を参照してください。簡潔さと正確さのために、これらの結果はここでは再現しません。簡単に言えば、以前の結果は、シアノバクテリアと酵母の長期共培養の確立に重要ないくつかの考慮事項を示しています。主な関心事は、シアノバクテリアが固定炭素の唯一の形態を提供する条件下で酵母が生存する能力は、酵母株がショ糖を利用できる効率に強く依存していることです。ショ糖27,28をより効率的に代謝するように進化または操作されたS.cerevisiae株は、共培養増殖モードへの移行を生き残る可能性が高く、より高い細胞密度を達成し、長期(数日から数週間)のシアノバクテリア共培養実験でより高い堅牢性を示しました8。共培養物への接種の初期段階は、おそらく培養希釈のストレス、培地組成の切り替え、および/またはより高濃度の炭素源の回収により、酵母の生存率にとって特に重要でした。したがって、共培養開始時に、より豊富な増殖培地から最小限の炭素利用可能性への移行を容易にする努力により、実験のパフォーマンスと一貫性を向上させることができます(ステップ1.2.1.1を参照)。さらに、S. cerevisiaeは、S. elongatusの密集した培養物に接種すると、高酸素と一致するストレス応答を示し、酸素光合成の主要な副産物としてのO2の形成と一致しました。したがって、シアノバクテリアパートナーの異常増殖および/または「昼/夜」の光サイクルを交互に繰り返すのを防ぐ努力は、長期共培養における出芽酵母の生存率を大幅に延長する可能性があります。共培養で一般的な現象の追加の要約については、axenic コントロールサンプルに関連する考察セクションを参照してください。
さまざまな方法論を使用した共培養の成長のモニタリング 次のセクションでは、3つの異なる方法を使用した Synechocystis と2つの酵母 S.cerevisiae および U.maydis の人工的に混合された三者コンソーシアムの例示的な定量化について説明します。混合物については、単一培養物のOD750 (シアノバクテリア用)およびOD600 (従属栄養生物用)を決定し、OD 0.1に調整しました。単一培養物を光学濃度を用いて1:1:1の比率で混合した(これは細胞数とは異なる、上記参照)。サイトメーターにおける酵母の識別を容易にするため、遺伝子組み換え S.cerevisiae FY1679-O1B29 のレポーター株は、細胞質mKate2(遺伝子型:URA3Δ/pTDH3::mKate2;株: S.cerevisiae mKate230)および U.maydis 株AB3331 eGFP (遺伝子型:pep4Δ/pRpl40::egfp;株: U.maydis eGFP32)を使用した。注目すべきは、シアノバクテリア株には、黄色の蛍光タンパク質バージョンmVenus(Synechocystis sp.PCC 6803 pSHDY-Pcpc560-mVenus、株 Synechocystis mVenus、33に類似)およびさらに、光合成機械の存在により典型的な強い自家蛍光を示します。
計数チャンバーを使用した顕微鏡定量: 3つの微生物の人工混合物中のすべての細胞型は、顕微鏡で容易に識別することができます（図2A）: シネコシスティス および 出芽酵母 は、その直径が大きく異なる球状細胞で表されます（シネコシスティス:直径約1.5〜3μm、 出芽酵母:直径約3〜6μm)一方、 ユコ サイジス菌は葉巻状の細長い形態で、長さは少なくとも10μmです(図2A)).これらの明確な形態学的特性により、混合物中の各パートナーの正確な定量化が可能になります。例として、37、18、36、および21 の出芽酵母 細胞が、それぞれ4つの大きな正方形にカウントされます(図2B)。平均値は 28 セルです。使用した血球計算盤の大きな正方形の面積は1 mm2 で、チャンバーの深さは0.02 mmであったため、0.02 μLあたり28個の細胞が得られます。これは1,400細胞/μLに相当し、1.4 x 106 細胞/mLに相当します。他の細胞タイプをカウントし、それに応じて濃度を決定しました(図2C、 表2)。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67311/67311fig02.jpg"> 
図2: Synechocystis と酵母S.cerevisiae および U.maydisからなる三者コンソーシアムの顕微鏡的定量化。 (A)示された微生物の人工的に結合された混合物の顕微鏡的微分コントラスト(DIC)画像。すべての種は、その形態によって簡単に区別できます。スケールバー:10μm.(B)ODが0.1の無軸培養物に基づく示された菌株の人工的に組み立てられた混合物の例示的な計数結果。グリッドエッジの4つの大きな正方形が分析されました( 図1Dの赤いマーク)。(C)4つの正方形でカウントされた異なる細胞の平均値を使用して、懸濁液中の細胞の濃度を次の式で計算しました:平均値/(チャンバーの深さ[0.02mm]×カウントされた正方形のサイズ[1mm2]×1,000)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67311/67311fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
パーティクルカウンターを使用した定量化: パーティクルカウンターは、懸濁液内の粒子の数をそのサイズに応じて決定します。このデータセット例では、45 μm のキャピラリーを備えたパーティクルカウンターを使用しました。 S. cerevisiae 細胞と U. maydis 細胞は同様の寸法を示すため、粒子カウンターでは区別できませんが、小さな シネコシスティス 細胞は明確に分離できます。したがって、単一培養物の分析では、2 つの酵母の 3 μm から 6 μm を参照する同一の位置にピークが見られます(図 3A)。測定中、負圧が加えられ、細胞が毛細血管に入ります。これにより、電気抵抗が一時的に変化し、デバイスがその変化に基づいて粒子サイズを決定できるようになります。混合培養では、2つの異なるピークが検出され、1つは小さなシアノバクテリア細胞に関連し、もう1つは2つの酵母種の結合画分を表します(図3B)。重要なことに、生細胞を反映するピークに加えて、細胞の破片や小さな粒子に対応する追加のピークが約1μm(図3)で検出されました。予想よりも大きな直径で現れるシグナルは、細胞の凝集によって引き起こされる可能性があります。注目すべきは、ピークの形状が細胞の均質性を反映していることです:鋭いピークは非常に均質な細胞を示し、これは共培養ではありそうにありません。共培養では、非常に広いピーク、または共培養のパートナーのサイズが明らかに異なる場合は2つのピークが見られることが予想されます。従属栄養菌の無軸培養の場合、ピークは中程度の幅のピークである可能性があります。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67311/67311fig3v2.jpg"> 
図3: Synechocystis mVenusと酵母S . cerevisiae mKate2および U. maydis eGFPからなる三者コンソーシアムの粒子カウンターを使用した定量化。 (A)グラフに示されている3つの菌株の無菌培養の解析の視覚的出力(45μmキャピラリーのセルカウンター)。(B)同一の条件を用いた人工三者コンソーシアムの分析のための例示的な視覚出力ファイル。パーティクルカウンターは、2番目のピークで表される2つの酵母種の識別をサポートしません。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67311/67311fig3v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
シングルセルサイトメトリーを用いた定量: シングルセルフローサイトメーターを使用すると、さまざまな細胞集団を、その(自動)蛍光特性と光散乱特性に基づいて簡単に区別できます。光合成細胞(Synechocystis)は、APC-Hチャネルで測定される光合成色素の赤色自家蛍光に基づいて、従属栄養細胞(U.maydis および S.cerevisiae)から分化することができる(図4A)。光栄養細胞と従属栄養細胞の初期分離に基づいて、2つの従属栄養集団は、FITC-HチャネルのeGFPとPC5.5チャネルのmKate2の蛍光マーカーに基づいて区別できます(図4B、C)。3つの母集団(FSC-HおよびFSC-Width)すべての散乱特性を示すドットプロットでは、母集団のわずかな重複だけで母集団を区別することもできます(図4D)。
この分析法では、希釈したサンプル10μLを10μL/minの流速で分析し、1分間で約70,000個の細胞を定量することができました。これらの細胞の約60%を シネコシスティス (4.23 x 106細胞/mL)に割り当てることができ、残りの40%は U. maydis (1.35 x 106 細胞/mL)と S. cerevisiae (1.36 x 106 細胞/mL、図4E、 表2)に均等に分布していました。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67311/67311fig04.jpg"> 
図4:シアノバクテリアSynechocystis mVenusと酵母U. maydis eGFPおよびS. cerevisiae mKate2からなる三者コンソーシアムのシングルセルフローサイトメトリーを用いた定量。 Synechocystis mVenus(濃緑)、U. maydis eGFP(薄緑)、S.cerevisiae mKate2(赤)の混合培養を1/3 OD750 / 1/3 OD600 / 1/3 OD600の比率でサイトメーター(A)で測定した後に得られたプロット例 APC-Hチャネル(例:638 nm、 em.:660/10 nm)は、自家蛍光に基づいて光合成細胞と従属栄養細胞を区別するために使用されたすべての細胞の100/10 nmです。(B)U. maydis eGFP細胞とS. cerevisiae mKate2細胞の緑色蛍光特性に基づいて分化するために使用したすべての従属栄養細胞のFITC-Hチャネル(例:488 nm、em.:525/40 nm)のイベントカウントと蛍光のヒストグラム。(C)U. maydis eGFP細胞とS. cerevisiae mKate2細胞の赤色蛍光特性に基づいて分化するために使用したすべての従属栄養細胞のPC5.5-Hチャネル(例:561 nm、em.:710/50 nm)のイベントカウントと蛍光のヒストグラム。(D)蛍光特性を持たない細胞集団を同定するために使用される、FSC-Hチャネル上のFSC-Widthの散乱信号のドットプロット。(E)関連する蛍光チャネルのイベントカウント、パーセンテージ、算術平均、標準偏差(SD)を含む母集団統計。細胞の総量は、そのサイズと蛍光とともに、10μLの容量で10μL/分の流量で決定されました。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67311/67311fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
さまざまな定量化方法の出力を比較に視覚化するために、決定されたセル番号を次の 2 つの表 (表 2 と 表 3) に示します。前述の3つの方法を使用して決定された細胞の最終濃度は、すべての方法で同様の範囲にあります。サイトメーターは最も高いサンプルサイズを提供し、次にパーティクルカウンターと顕微鏡定量を提供し、メソッド間で約1桁減少します。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">共文化 1:1:1</td>
			<td>光度計</td>
			<td colspan="2">サイトメーター</td>
			<td colspan="2">パーティクルカウンター</td>
			<td colspan="2">顕微鏡計数チャンバー</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">生物</td>
			<td>外径750/600</td>
			<td>セル数</td>
			<td>細胞数/mL</td>
			<td>セル数</td>
			<td>細胞数/mL</td>
			<td>セル数</td>
			<td>細胞数/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Saccharomyces cerevisiae mKate2</td>
			<td>0.0333</td>
			<td>13,618</td>
			<td>1.36×106</td>
			<td rowspan="2">1,546*</td>
			<td rowspan="2">2.58 x 106*</td>
			<td>112</td>
			<td>1.40×106</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Ustilago maydis eGFP</td>
			<td>0.0333</td>
			<td>13,541</td>
			<td>1.35×106</td>
			<td>89</td>
			<td>1.11×106</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Synechocystis sp. PCC 6803 mVenus</td>
			<td>0.0333</td>
			<td>42,330</td>
			<td>4.23×106</td>
			<td>3,094</td>
			<td>5.16×106</td>
			<td>271</td>
			<td>3.39×106</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2:さまざまな定量化方法の比較:人工混合培養。 なお、U. maydis とS. cerevisiae は、パーティクルカウンター(*)では区別できません。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">単一文化</td>
			<td>光度計</td>
			<td colspan="2">サイトメーター</td>
			<td colspan="2">パーティクルカウンター</td>
			<td colspan="2">顕微鏡計数チャンバー</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">生物</td>
			<td>外径750/600</td>
			<td>セル数</td>
			<td>細胞数/mL</td>
			<td>セル数</td>
			<td>細胞数/mL</td>
			<td>セル数</td>
			<td>細胞数/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Saccharomyces cerevisiae mKate2</td>
			<td>0.1</td>
			<td>38,936</td>
			<td>3.89×106</td>
			<td>1,928</td>
			<td>3.21×106</td>
			<td>403</td>
			<td>4.03×106</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Ustilago maydis eGFP</td>
			<td>0.1</td>
			<td>36,927</td>
			<td>3.69×106</td>
			<td>2,465</td>
			<td>4.11×106</td>
			<td>307</td>
			<td>3.07×106</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Synechocystis sp. PCC 6803 mVenus</td>
			<td>0.1</td>
			<td>127,864</td>
			<td>1.28×107</td>
			<td>8,186</td>
			<td>1.36×107</td>
			<td>428</td>
			<td>1.07×107</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表3:さまざまな定量方法の比較:単一/無軸培養によるキャリブレーション。

With the increasing demand for sustainable biotechnologies, mixed consortia containing a phototrophic microbe and heterotrophic partner species are being ...

私たちの研究は、スクロース分泌シアノバクテリアと従属栄養菌が関与する合成コンソーシアムにおける微生物ネットワークを理解することを目的としています。以前は、微生物学者は通常、単一の微生物の純粋な培養を研究していました。しかし、自然界では、微生物は通常コンソーシアムで発生するため、混合培養における微生物のネットワークも理解することが不可欠です。大きな課題の1つは、すべてのコンソーシアムメンバーの成長を可能にする培地を含む、適切な成長条件を見つけることです。ここでは主に、従属栄養メンバーの成長の基礎を提供する光栄養メンバーによる最高のショ糖産生と分泌の最適化に焦点を当てています。無菌培養での成長を追跡するために、光学密度や後方散乱測定などの一般的な手法を使用できます。ただし、これらの手法は、個々の種の細胞数が必要な共培養には適用されません。私たちのプロトコールでは、蛍光標識と細胞計数の組み合わせを適用して、異なる共培養パートナーを区別します。さらに、シンプルで低コストの方法から高価で高スループットの方法まで、さまざまな方法で同様の結果を達成できることを示すことができます。まず、培養液を3日間培養した後、シアノバクテリア細胞をペレット化します。ペレットを25ミリリットルの滅菌CoYBG-11培地に再懸濁します。サンプルを4, 000gで室温で20分間遠心分離します。次に、デカンテーションして上清を捨てます。光学濃度が決定されたら、無菌条件下で250ミリリットルのバッフルフラスコに計算された量のCoYBG-11を追加します。その後、計算された量のシアノバクテリアおよび従属栄養細胞懸濁液を添加して、最終培養量を50ミリリットルにします。50ミリリットルの培養には、1モルのIPTGストックから50マイクロリットルを使用します。次に、フラスコをフォトインキュベーターに約200マイクロモルの光子/平方メートル/秒で置きます。摂氏30度で2%の二酸化炭素、150RPMで軌道振とう、および75%の湿度で環境を補います。サンプリングのために、インキュベーターからフラスコを取り出し、無菌条件下で培養物から1ミリリットルのサンプルを採取します。顕微鏡による定量に備えるために、計数チャンバーとカバーガラスにほこりや細胞がないことを確認してください。カバーガラスを2つのサポートバーにスライドさせて、破損を防ぎながら少し力を入れて正しく配置します。カバーガラスを適切に配置したら、カバーガラスが滑らないようにしながら、2つのガラス表面の間のニュートンリングを観察します。次に、細胞懸濁液を完全に混合し、チャンバーの端に数マイクロリットルを塗布します。チャンバーが毛細管の力で完全に満たされるようにします。次に、光学顕微鏡の適切な対物レンズを使用し、計数チャンバーのグリッド線に焦点を合わせます。指定されたセルサイズに適した正方形のセルを数えます。粒子計数による定量化では、サンプルの光学濃度を0.1に調整します。次に、10マイクロリットルのサンプルを10ミリリットルの等張測定バッファーに加えます。サンプルカップの蓋を固定し、カップを少し傾けてサンプルを優しく混合します。サンプルカップをパーティクルカウンターに置いた後、利用する細胞に適した細孔径のキャピラリーをサンプルカップに挿入し、機械のドアを閉めます。測定を開始し、適切な範囲で記録します。この段階では、セルサイズが異なるセルを識別できます。シングルセルフローサイトメトリーによる定量では、サンプルの光学濃度を調整して、サイトメトリー測定に適した位置に配置してください。所定の式を適用して、セル数が毎分10マイクロリットルの流量で毎秒1, 000〜10, 000セルの範囲内に留まるようにします。各サンプル細胞懸濁液の300マイクロリットルを96ウェルプレートの個々のウェルに移します。次に、96ウェルプレートをサイトメーターの自動サンプルに移します。サンプルに関連する蛍光チャネルと散乱チャネルのドットプロットとヒストグラムを開きます。細胞濃度を決定するには、レコード機能を使用して定義されたサンプル量を記録します。APC-Hチャネルのヒストグラムを使用して、光栄養生物の赤色自家蛍光に基づいて、光生物と従属栄養生物のシグナルを分離します。次に、従属栄養集団のみを表示するFITC-Hチャネルのヒストグラムを使用して、緑色蛍光タンパク質を含む従属栄養細胞を同定します。PC5.5-Hチャンネルのヒストグラムを使用して、赤色蛍光タンパク質を含む従属栄養細胞と赤色蛍光タンパク質を含まない細胞を区別します。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

出典: Jiang, H., Ho, M. シアノバクテリアにおける無傷のフィコビリソームの単離と特性評価。J. Vis.

バイオマス生産のためのシアノバクテリア培養物の調製

我々は、倒立顕微鏡を用いて流出液中の微生物、定期的に画像を細胞の培養物を照明する光遺伝学システムを使用するための連続的な培養装置を設計しました。照明の動的応答は、数日間にわたって測定することができるように培養、サンプリング、画像化、および画像解析は完全に自動化されています。...

微生物光遺伝学アプリケーションのための自動照明、培養、およびサンプリングシステムの設計と実装

ここでは、i)CyanoGateモジュラークローニングツールキットを用いて自己複製ベクターを組み立てる方法を記述するプロトコルを提示し、ii)結合によりシアノバクテリア宿主にベクターを導入し、iii)を用いてトランスジェニックシアノバクテリア株を特徴付ける。プレートリーダーまたはフローサイトメトリー。...

シアノゲートモジュラークローニングツールキットを用いたコンジュゲーションによるシアノバクテリアの遺伝子改変

液体クロマトグラフィーとタンデム質量分析法を用いたサッ カロミセス・セレビシエ の定量的メタボロミクス

微生物代謝の光遺伝学的制御は、発酵プロセスに対する柔軟な動的制御を提供する。ここでのプロトコルは、異なる体積スケールでの化学およびタンパク質生産のための青色光調節発酵を設定する方法を示しています。...

微生物化学およびタンパク質生産のための光制御発酵

現在のプロトコルは、不連続なスクロース密度勾配を介して遠心分離によってシアノバクテリアからのフィコビリソームの分離を詳述する。77K蛍光発光スペクトルとSDS-PAGE分析により、インタクトなフィコビリソームの画分が確認されます。得られたフィコビリソーム画分は、TEMの陰性染色および質量分析分析に適しています。...

シアノバクテリアにおけるインタクトフィコビリソームの分離と特徴付け

この研究では、主な目的はカーボンナノチューブ(CNT)の細胞への取り込みと最終的なエキソサイトーシスを監視することでした。この観点から、ここでは、マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーを使用して、統計的に関連性のある数の細胞におけるCNTの定量と局在を可能にする独自の方法を提案しました。...

マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーによる細胞内カーボンナノチューブの局在と相対定量(英語)

単一または複数の細胞外マトリックスタンパク質からナノファイバーおよび複合ナノ構造体を得るための方法が記載されている。この方法は、組織工学及びバイオテクノロジーの様々なアプリケーションで使用するために調整可能な組成物およびアーキテクチャに自立タンパク質ベースの材料を作成するために、タンパク質 - 表面相互作用を使用する。...

表面開始アセンブリの使用ECMタンパク質のナノファイバーおよびナノ構造エンジニア

サポートされている脂質二重層と天然膜粒子は、細胞膜の特性を近似することができると分析種々の戦略に組み込むことが好都合システムである。ここでは、サポートされている脂質二分子膜でコーティングされたSiO 2ビーズ、リン脂質小胞または天然の膜粒子からなるマイクロアレイを調製するための方法を実証する。...

スキージベースアセンブリ法による生体膜マイクロアレイの形成

この原稿は、内皮の生理学的特性を再現微小血管を設計するための射出成形方法を提供します。マイクロ流体ベースのプロセスは、このような流れ、細胞組成、幾何学、および生化学的勾配などの調整可能な条件、との特許の3D血管ネットワークを作成します。製造プロセスと潜在的な用途の例について説明します。...

微細と3D微小血管の組立

学ぶ 光合成シアノバクテリアと従属栄養酵母の共培養システムの組み立てと定量化手法。蛍光標識、粒子計数、フローサイトメトリーによる個別種の追跡と微生物ネットワーク解析に役立つ。

従属栄養酵母と光合成糖分泌シアノバクテリアを組み合わせた共培養物の組み立てと定量化

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