低コストポリエチレンテレフタレートラミネートラミネートマイクロ流体工学による多重ゼブラフィッシュイメージングのための設計

当研究室では、創傷治癒における細胞内カルシウムシグナル伝達の特徴と生物学的意義に焦点を当て、組織損傷、感染症、および癌における好中球の移動と活性化を調節するメカニズムに関心を持っています。

[シェリー]従来のマイクロ流体設計手法はコストがかかり複雑であるため、発生生物学など多様な環境を必要とする分野での進歩が遅れています。個々の設計を開発およびテストするための、より迅速かつ効率的なアプローチが見られました。したがって、この構築方法は、同様に単純なプロトコルよりも優れた設計の柔軟性と空間分解能を提供すると同時に、標準のPDMSデバイスよりも高速で簡単な反復を可能にします。これを使用して、単一の視野内で複数のゼブラフィッシュ胚を同時に画像化するRADISHを開発しました。

高解像度のライフイメージングをサポートするこの閉じ込め装置により、化学的刺激や機械的刺激などの多様な信号が炎症と創傷治癒を調整するためにどのように統合されているかを理解することができます。

[講師]まず、選択したソフトウェアを使用してデバイスのパターンを設計します。胚の年齢とサイズに応じて、チャネルの幅と中央イメージングチャンバーのサイズを調整して、最適なフィット感にします。各レイヤーを同じサイズの個別の画像ファイルとして保存します。次に、製造元の指示に従って切断機を初期化します。デザインワークスペースで、新しくアップロードされたデザインを選択します。同じ厚さのPETシートを想定したパターンを同じカットにまとめます。カットのパターンの数と種類を確認し、カット材料を選択します。次に、PETシートを希望の厚さでカッティングマットにしっかりと押し付けて気泡を取り除き、マットをカッティングマシンにセットします。画面上の指示に従って、切断機に切断を開始するように求めます。次に、完成したカットをカッティングマットから取り除きます。次に、カバースリップガラス上の層を、補助なしで、または事前にカットされたレジストレーションマークで位置合わせします。ラミネート中にずれないように、層をオフィステープで固定します。デバイスのサイズとラミネーターの容量に応じて、ラミネーターフィードの詰まりや目詰まりを避けるために、小さなデザインをより多くのテープを使用して大きな裏地に取り付けます。その後、ラミネーターの電源を入れ、メーカーの指示に従ってラミネートします。次のレイヤーを揃える前に、オフィステープを剥がします。シアノアクリレート接着剤を使用して、4分の3インチの穴が開けられた35ミリメートルの皿にデバイスを固定します。次に、デバイスの外側の端をシアノアクリレート接着剤で完全にコーティングして、ラミネートを防水します。外縁を隙間なく完全に覆うのに十分な接着剤を使用します。まず、ゼブラフィッシュの胚をE3または別の適切な胚飼育培地で受精後少なくとも2日まで育てます。次に、1リットルあたり164ミリグラムのMS-222を使用して胚を麻酔します。次に、取り付けられたデバイスを含む保持皿に、5ミリリットルのE3または1リットルあたり164ミリグラムのMS-222を含む別の胚培地で満たします。トランスファーピペットを使用して、1つの麻酔胚をデバイスの各保持チャンバーに預着させます。次に、ヘアループを使用して、各胚の尾部が中央のイメージングチャンバーに突き出た状態で胚を向き、卵黄をくさび形のチャネルに固定します。必要に応じて、マイクロピペットを使用して1.5%の低融点アガロースを保持チャンバーに加えることにより、胚の頭部を固定します。最後に、胚を含むデバイスを選択したイメージングシステムに移動してイメージングを開始し、実験に適したイメージングシステムと目的を選択します。サンプルフォーカスとイメージングパラメータを調整して、最適な信号対雑音比と取得速度を実現します。手動切断によって胚を傷つけるには、実体顕微鏡下で脊索の先端にある尾びれ組織全体にメスの刃で圧力を加えます。次に、デバイスをステージに戻します。レーザー刺激によって胚を傷つけるには、尾びれのひだの端近くに関心領域を定義し、利用可能なレーザー出力に従って刺激します。GFPおよびRFPチャネルを使用して、室温で胚を1分のフレーム間隔で合計1時間画像化します。必要に応じて、イメージング後にトランスファーピペットを使用して頭の近くをそっと吸引するか、皿を回転させて胚を解放します。