2種類の接着細胞株を用いた共培養モデル

当研究所の名称である母体胎児医学研究所が示すように、当研究所の研究は主に女性の生殖生物学に焦点を当てています。私たちは、生殖障害のメカニズムを理解し、その治療の標的となる可能性を特定することを目指しています。このアプローチの主な利点の1つは、市販の共培養システムと比較して、時間と支出が大幅に削減されることです。

自家製の足場は、すぐに入手できる材料で作られているため、セットアップのコストが大幅に削減されます。このマルチセルin vitroモデルは、移植領域の複雑なin vivo解剖学的構造をよりよく表しています。今後、当研究室では、この混合播種マルチセルin vitroモデルに他の細胞種を導入し、子宮内膜損傷や子宮内付着などの疾患の病因における着床研究と子宮機能についてさらに研究を進めていきます。

まず、モデル構築用の3Dプリントされた足場を入手します。細胞培養の場合は、清潔で滅菌済みの18mm四方のカバースリップを12ウェルプレートの底に置きます。カバーガラスに200マイクロリットルの細胞外マトリックスを200〜300マイクログラム/ミリリットルの濃度でコーティングします。

プレートを摂氏37度に1時間保ちます。次に、プレートから細胞外マトリックスを取り除きます。次に、以前に培養したヒト胚性幹細胞と石川細胞を顕微鏡で観察し、適切なコンフルエンシーを確認します。

次に、使用済みの培地をウェルから取り出し、3ミリリットルのPBSで細胞を2回洗浄します。次に、細胞を摂氏37度で2ミリリットルの解離酵素と2分間インキュベートして細胞を分離します。完全な培地を使用して反応を中和します。

次に、ピペッティングで上下させて単一細胞懸濁液を作成します。次に、100マイクロリットルの細胞懸濁液をトリパンブルーと混合し、希釈係数を2に保ちます。次に、カバースリップを血球計算盤チャンバーの上にスライドさせます。

両方のサイドチャンバーにトリパンブルーを混ぜた細胞懸濁液を入れます。20倍顕微鏡で両側の正方形の細胞の数を数え、その数に基づいて細胞密度を計算します。次に、新鮮な培地を含む調製プレートに10の濃度でヒト胚性幹細胞を1ミリリットルあたり5細胞の累乗で播種し、5%の二酸化炭素で摂氏37度で24時間インキュベートします。

石川細胞株の場合は、翌日、カバースリップなしで細胞をウェルに播種します。足場をエチルアルコールと二重蒸留水に2日間十分に浸します。浸した後、二重蒸留水を取り除き、金属缶を密封します。

次に、121°Cのオートクレーブを使用して足場を滅菌します。その後、乾かします。約2ミリリットルの相補培地を石川細胞の入ったウェルに加えます。

ヒト胚性幹細胞を付着させたカバースリップを足場に移し、細胞側を下にして位置決めします。足場を石川細胞を含むウェルに差し込みます。2番目のセットアップでは、石川細胞の入ったカバースリップを足場に置き、胚性幹細胞を含むウェルに差し込みます。

共培養システムを摂氏37度で5%の二酸化炭素とインキュベートします。ウェルから培地を慎重に取り出し、滅菌PBSで細胞を穏やかにすすいでください。細い鉗子またはピンセットを使用して、細胞が付着したカバースリップを培養皿から取り外します。

必要に応じて、カバースリップをPBS入りの新しい皿に入れて、移し替えプロセス中にカバースリップを水分補給します。清潔な顕微鏡スライドにPBSを一滴加え、細胞が入ったカバーガラスを滴下にそっと移し、細胞がスライド上に下向きになるようにします。準備したスライドを倒立顕微鏡のステージに置きます。

適切な対物レンズを選択し、粗いフォーカスノブと細かいフォーカスノブを使用してフォーカスを調整します。照明強度やカメラ設定など、顕微鏡のパラメータを設定します。顕微鏡ソフトウェアを使用して、目的の倍率と視野で画像をキャプチャします。

72時間後も共培養条件では、両細胞タイプの密度は低いままでしたが、独立して培養した細胞密度は大幅に増加しました。共培養したヒト胚性幹細胞の長さは、独立して培養した細胞よりも短かった。