Name: 成体マウスからの海馬ミクログリアの単離と全細胞パッチクランプ記録 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-27T14:47:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: 学ぶ成体マウス海馬ミクログリアの単離と全細胞パッチクランプ記録法。酵素消化と蛍光活性化細胞分画を用いて生理的イオンチャネル活性を解析し、神経免疫学研究に有用な手法を確立する。

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<meta charset="utf8"></head><body>成体マウスの海馬ミクログリアの電気生理学的記録

<ol><li>Ginhoux, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+mapping+analysis+reveals+that+adult+microglia+derive+from+primitive+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages.</a> Science. 330 (6005), 841-845 (2010).</li>
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<li>Keren-Shaul, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unique+microglia+type+associated+with+restricting+development+of+alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A unique microglia type associated with restricting development of alzheimer's disease.</a> Cell. 169 (7), 1276-1290.e17 (2017).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Various+cell+populations+within+the+mononuclear+fraction+of+bone+marrow+contribute+to+the+beneficial+effects+of+autologous+bone+marrow+cell+therapy+in+a+rodent+stroke+model%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Stroke+Res%22%5BJournal%5D)">Various cell populations within the mononuclear fraction of bone marrow contribute to the beneficial effects of autologous bone marrow cell therapy in a rodent stroke model.</a> Transl Stroke Res. 7 (4), 322-330 (2016).</li>
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<li>Ramesha, S., Rayaprolu, S., Rangaraju, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+approach+to+characterize+phagocytic+properties+of+acutely-isolated+adult+microglia+and+brain+macrophages+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry approach to characterize phagocytic properties of acutely-isolated adult microglia and brain macrophages in vitro.</a> J Vis Exp. 160, e61467(2020).</li>
<li>Mccarthy, K. D., De Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+separate+astroglial+and+oligodendroglial+cell+cultures+from+rat+cerebral+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.</a> J Cell Biol. 85 (3), 890-902 (1980).</li>
<li>Sakmann, B., Edwards, F., Konnerth, A., Takahashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+techniques+used+for+studying+synaptic+transmission+in+slices+of+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Q+J+Exp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Patch clamp techniques used for studying synaptic transmission in slices of mammalian brain.</a> Q J Exp Physiol. 74 (7), 1107-1118 (1989).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>100 mmペトリ皿</td><td>Corning</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Falcon チューブ</td><td>BD</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>24ウェルプレート</td><td>BD</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>35 mm ペトリ皿</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>353001-50 mL Falcon チューブ</td><td>BD</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu;m細胞スクリーニング</td><td>Miltenyi</td><td>130-095-823</td><td>細胞選別前に細胞塊を除去するには</td></tr><tr><td>、成体マウス脳解離キット</td><td>Miltenyi</td><td>130-107-677</td><td></td></tr><tr><td>抗CD11b抗体</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA74</td><td>ヤギ抗マウスIgGも利用できます。内因性免疫グロブリンを遮断するため。</td></tr><tr><td>抗IBA1抗体</td><td>SYSY</td><td>234308</td><td>ヤギ抗モルモットIgG)も入手可能です。内因性免疫グロブリンを遮断するため。</td></tr><tr><td>Axon Digidata 1440A</td><td>USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axon MultiClamp 700B Amplifier</td><td>USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA アルブミン フラクション V</td><td>BioFrox</td><td>4240GR500</td><td>血清</td></tr><tr><td>C57BL/6 マウス&nbsp;</td><td>広東省医療実験動物センター</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD11 b/c マイクロビーズ</td><td>Miltenyi</td><td>130-105-634</td><td></td></tr><tr><td>クロラール水和物ア</td><td>ブシン abs47051394</td><td></td><td>マウスの麻酔として広く使用されています</td></tr><tr><td>Clampfit 10.6</td><td>米国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>Zeiss</td><td>&nbsp;LSM 800</td><td></td></tr><tr><td>培地</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>C11995500BT-DAPI</td><td></td></tr> <tr><td>色素</td><td>Beyotime</td><td>C1002</td><td></td></tr><tr><td>電極プーラー</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Servicebio</td><td>G4203</td><td></td></tr><tr><td>水平シェーカー</td><td>SCILOGEX</td><td>SLK-O3000-S</td><td></td></tr><tr><td>画像解析ソフト</td><td>フィジー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MACS カラム</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>MACS セパレーター</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-102</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>Fisher Scientific</td><td>T353-500</td><td>1X PBS、pH 7.2-7.4 の新鮮な 4% 溶液を使用します。</td></tr><tr><td>ポリ-L-リジン</td><td>Beyotime</td><td>&nbsp;C0313</td><td>カバースリップコーティング</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr></tbody></table>

成体マウスからの海馬ミクログリアの単離と全細胞パッチクランプ記録

Isolation and Whole-Cell Patch-Clamp Recording of Hippocampal Microglia from Adult Mice

簡単に言うと、このプロセスには、成体マウスの脳からの海馬ミクログリアの単離と、それに続くこれらの細胞の全細胞パッチクランプ記録が含まれます(図1)。この手順は、生後3〜5か月のC57BL / 6J成体マウスの海馬を解剖することから始まります。具体的には、灌流後に脳全体を取り出し、氷冷したPBSを含む培養皿に入れます(図2A)。海馬から細胞を急性に分離するために、大脳皮質を切除し、三日月形の海馬組織を無傷で単離します(図2B)。
最適な細胞品質とその後の高品質な全細胞パッチクランプ記録のためには、シングルセル懸濁液の調製中の消化時間を制御することが重要です。この研究では、酵素混合物中の海馬組織を一貫して手動で攪拌し、消化時間を15分以内に厳密に制限しました(図3)。次に、細胞をMACS法を使用して単離し、86.20%±0.68%19,20の純度を達成しました。これらの選別された細胞がミクログリアであることを確認するために、ミクログリアの検出に広く使用されている抗Iba1抗体および抗CD11b抗体を用いた免疫蛍光法により、ミクログリア表面マーカーを試験した18。その結果、単離された細胞はCD11bおよびIba1陽性であり、ミクログリアの単離が成功したことが確認されました(図4)。
最後に、急性に分離されたミクログリアが追跡実験に高品質であるかどうかを評価するために、ミクログリアカリウム電流を評価するための全細胞パッチクランプ記録の実行方法について説明します。記録されたミクログリアの平均膜容量は10.42±2.05でした(図5)。その結果、ミクログリアカリウム電流を記録できることが示され、急性に分離されたミクログリアが神経生物学的研究に適していることが示されました。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67315/67315fig01.jpg"> 
図1:実験手順の概要。 脳組織を注意深く抽出し、海馬を両側に解剖するという4つの主要なステップがあります。海馬組織を消化して、プロトコルのセクションで詳述されているように、酵素混合物を使用して単一細胞懸濁液を調製します。標的細胞は、磁気活性化細胞選別法によって単離されます。また、急性に単離された細胞のカリウム電流は、全細胞パッチクランプ記録によってアッセイされます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67315/67315fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67315/67315fig02.jpg"> 
図2:海馬の解剖(A)生後3〜5か月のマウスの脳全体。(B)孤立した両側海馬。スケールバー:0.5 cmこの<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67315/67315fig02large.jpg" target="_blank">図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67315/67315fig03.jpg"> 
図3:海馬組織の消化を示す概略図。 重要な実験ステップの図は、海馬組織が1細胞懸濁液に消化されることを確認するために、最大15分間の連続振とうで37°Cで酵素混合物を添加することにより、この <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67315/67315fig03large.jpg" target="_blank">図の拡大版を表示するためにここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67315/67315fig04.jpg"> 
図4:急性に分離された海馬ミクログリアの同定。 海馬から精製されたCD11b(緑)とIba1(赤)陽性細胞を示す代表的な共焦点画像により、単離された細胞がミクログリアであることが確認されました。スケールバー:10μmこの <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67315/67315fig04large.jpg" target="_blank">図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67315/67315fig05.jpg"> 
図5:全細胞ミクログリアカリウム電流の記録 (A) 記録電極は、単離された海馬ミクログリアの表面に配置されています。スケールバー:20μm.(B)電圧クランプ条件下での急性分離された海馬ミクログリアの代表的なカリウム電流。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67315/67315fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

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