成体マウスからの海馬ミクログリアの単離と全細胞パッチクランプ記録

私たちの研究は、イオンチャネル活性を理解するためのカリウム電流を含む全細胞記録のためにミクログリアを鋭敏に分離することに焦点を当てています。このプロトコルは、さまざまな脳領域のミクログリアの分離にも適応でき、さまざまな神経学的状態にわたるゼロに関する洞察を提供します。

私たちの研究分野における最新の開発には、蛍光活性細胞選別によるミクログリア精製と組み合わせた従来の膵炎酵素消化の使用が含まれます。これらの進歩により、さらなる研究のために特定のミクログリア集団を分離する精度と効率が向上しました。

私たちのプロトコルは、初代培養CSに依存するのではなく、成体マウス海馬から直接ミクログリアの電気生理学的特性を調査します。このアプローチにより、ネイティブ環境におけるミクログリア機能のより正確な分析が可能になります。

私たちの結果は、生理学的および疾患的条件の両方におけるミクログリアの生化学的および機能的特性に関する新たな科学的疑問への道を切り開き、研究者にこれらの側面をさらに調査するための貴重な指針を提供します。

[プレゼンター]まず、麻酔をかけた動物を解剖台に仰臥位に置き、手足を固定します。胸部を露出させ、氷冷の滅菌PBSで心臓を灌流し、血管内循環血球を除去します。次に、頭を持ち、はさみで脳の正中線に沿って皮膚を切り、頭蓋骨を露出させます。次に、頭蓋骨の後部を両側と眼窩の間を小さなハサミで切ります。矢状縫合糸に沿って頭蓋骨を切断し、ピンセットで頭蓋骨を取り除きます。その後、脳組織を素早く抽出します。次に、氷冷PBSを含む10センチメートルの培養皿に脳組織を入れます。ピンセットで大脳皮質を両側に解剖します。海馬組織を分離し、細かく切ります。破片を15ミリリットルの遠心分離管に移します。次に、海馬組織の小片を2ミリリットルの氷のように冷たいハンクス平衡塩溶液(HBSS)に再懸濁します。そして、室温で300Gで3分間遠心分離します。上清を廃棄した後、海馬組織片を含む15ミリリットルの遠心分離管に1,950マイクロリットルの酵素混合物1を加えます。遠心分離管を摂氏37度の水浴で5分間連続的に振とうします。次に、調製したばかりの酵素混合物2を30マイクロリットルを15ミリリットルの遠心分離管に加えます。1ミリリットルのピペットチップで組織断片を上下に20回ピペットし、摂氏37度で連続振とうしながらウォーターバスで5分間インキュベートします。遠心分離管を取り外した後、大きな組織片が残らなくなるまで、1ミリリットルのピペットで懸濁液を上下に複数回ピペットで移動します。次に、細胞懸濁液を70マイクロメートルの細胞スクリーニングフィルターでろ過し、濾液を清潔な50ミリリットルの遠心分離管に集めます。濾液を新しい15ミリリットルの遠心分離管に移し、摂氏4度で300Gで10分間遠心分離します。次に、1ミリリットルのピペットで上清を捨てます。次に、細胞懸濁液を15ミリリットルのHBSSで上下に20回ピペットで洗浄し、摂氏4度で300Gで10分間遠心分離します。上清を廃棄した後、細胞ペレットを1ミリリットルの磁気活性化細胞選別バッファーに再懸濁します。まず、調製した1ミリリットルの単一細胞懸濁液を2ミリリットルの微量遠心チューブに移し、摂氏4度で3分間300 Gで遠心分離します。上清が除去されたら、単一細胞ペレットを90マイクロリットルの磁気活性化細胞選別または最大バッファーに再懸濁します。10マイクロリットルのCD11bまたはcマイクロビーズを加え、懸濁液を摂氏4度で水平シェーカーで15分間インキュベートします。次に、1ミリリットルの最大バッファーをチューブに直接加えて、単一細胞懸濁液を洗浄します。遠心分離後、細胞ペレットを500マイクロリットルの最大バッファーに再懸濁します。1ミリリットルのピペットを使用して、再懸濁した細胞懸濁液を磁場中の選別カラムに移します。磁場中に残っている間に、カラムを500マイクロリットルの最大バッファーで3回洗浄します。次に、選別カラムを磁場から取り外します。最大バッファー1ミリリットルをカラムに加え、ピストンでゆっくりと押し込みます。流れを収集します。次に、選択した細胞を、ポリ-L-リジンでコーティングされたカバースリップを含む24ウェルプレートに播種します。200マイクロリットルの培地を加え、95%の酸素、5%の二酸化炭素、および60〜80%の湿度で摂氏37度のインキュベーターで20分間インキュベートします。まず、マウスの脳組織から単離した培養ミクログリアを取ります。40倍対物レンズを使用して、水顕微鏡下で球状ミクログリアの位置を特定します。次に、電極に細胞内溶液を満たし、電気生理学セットアップのアンプヘッドステージに取り付けます。陽圧をかけます。4倍対物レンズに切り替えて、電極を見つけます。次に、電極を浴溶液に下げます。 アンプを電圧クランプモードに設定して、バスモードでメンブレンテストを実行します。その後、40倍対物レンズに戻し、電極先端をミクログリアに近づけます。次に、小さな負圧を加えてセルを保持します。抵抗が100メガオームに達したら、メンブレンテストでバスモードからパッチモードに切り替えます。抵抗が 300 メガオームに達したら、負圧を解放します。抵抗が電極とミクログリア膜の間にギガオームシールの形成を示している場合。メンブレンテストでパッチモードからセルモードに切り替えます。次に、少量の吸引を加え、電気ショックを開始して膜を破裂させます。その後、電圧クランプモードに切り替えて、記録プログラムを開き、カリウム電流を200ミリ秒記録します。