NMRベースのメタボロミクスを用いた重症患者における代謝異常物の同定と定量

私たちの研究では、NMRベースのメタボロミクスを使用して、重症のICU患者で変化する代謝異常と生化学的経路を特定し、重度の肺疾患であるARDSの患者も含めています。代謝シグネチャーをプロファイリングおよび比較することにより、疾患の進行に関連する生化学的障害を明らかにし、治療をカスタマイズして結果を改善することを目指しています。実際、私たちは、軽度、中等度、重度のARDS患者を含むARDS患者のすべてのカテゴリーにおける代謝調節不全の理解におけるギャップに対処しようとしています。

私たちの洞察力を向上させ、病気とその進行をよりよく理解するために、精密で個別化された医療を提供することにより患者の転帰を改善することを全体的な目標としています。NMRは、再分析のための血清の完全性を維持し、化学誘導体化せずに既知および未知の代謝物を検出することで、サンプル調製を容易にします。再現性のある定量的データを提供し、信頼性の高い代謝物測定を保証します。

ターゲットを絞ったアプローチとは異なり、NMRは代謝変化を高感度かつ偏りなく探索できるため、疾患の進行におけるシグネチャーや経路を発見するのに理想的です。私たちの発見は、研究が進んでいないさまざまな段階での代謝変化を明らかにすることにより、ARDS 研究を強化します。NMRベースのメタボロミクスを用いて、調節不全の代謝物や経路を特定し、早期診断、予後、よりタイムリーな予測と治療のための潜在的な兆候につながることを目指しています。

このアプローチは、パーソナライズされた管理を進め、マルチステート代謝プロファイリングの知識を深めます。私たちの結果は、次のような新しい科学的質問への道を開きました:ARDSのさまざまな段階で特定された特定の代謝物は、疾患の進行にどのように影響しますか?これらの調節不全の経路は、早期の治療介入の標的にできるのでしょうか?

さらに、これらの代謝変化は、他の呼吸器疾患や炎症性疾患によってどのように異なるのでしょうか?まず、滅菌針を使用して、軽度または中等度の急性呼吸窮迫症候群またはARDSと診断された患者の動脈から2ミリリットルの血液を採取します。血液を滅菌バイアルに移し、室温で30分間凝固させます。

凝固した血液を3,100Gで15分間遠心分離し、血清を分離する。血清を滅菌マイクロ遠心チューブに移し、400〜500マイクロリットルのアリコートを作ります。チューブに患者の詳細をラベル付けし、摂氏80度で保管します。

NMR実験では、250マイクロリットルの血清アリコートと250マイクロリットルの生理食塩水リン酸緩衝液を混合して、pHの変動を最小限に抑えます。混合物を約15秒間ボルテックスして、均質な混合を確保します。調製したサンプルを、0.05ミリモルの濃度でTSPを含む同軸インサートを備えたきれいなNMRチューブに移します。

次に、NMRチューブを磁石の中に入れます。WRPAと入力し、適切な実験番号を選択して、CPMGパルスプログラムを使用した陽子線実験を設定します。「タイトル」オプションをクリックして、患者の名前とその他の必要な詳細を入力します。

lock と入力して Enter キーを押すと、磁場がロックされます。次に、90%waterおよび10%deuterium oxideのオプションを選択します。次に、ATMMと入力してEnterキーを押し、プローブのチューニングとマッチングを実行します。

次に、から 取得パラメータ オプション、最適化データを収集するために、128回のスキャンで64, 000ポイントのパラメータを選択します。緩和遅延を 5 秒、スペクトル スイープ幅を 12 PPM に、エコー時間を 200 マイクロ秒に設定し、300 回繰り返します。指数ウィンドウ関数を使用して 0.3 ヘルツの線幅拡張を適用します。

次に、NMR処理および分析ツールを使用して、NMRスペクトルを取得します。最終的なスペクトルを取得したら、APKとABSNと入力して、位相補正とベースライン補正をそれぞれ実行します。次に、上部パネルの[Calibrate Axis]オプションをクリックし、TSPピークを自動または手動で0 PPMにキャリブレーションします。

最後に、取得したデータをNMRシステムからワークステーションに転送して、さらに分析します。軽度または中等度のARDSと診断された患者のNMRスペクトルを取得した後、データ処理用のNMR代謝物定量ソフトウェアを開きます。Whitaker法を使用して手動ベースライン補正を行うには、NMR代謝物定量ソフトウェアのプロセッサモジュールでスペクトルファイルを開きます。

ベースライン補正を選択し、Whitaker メソッドを選択します。スペクトル全体のピークの基部にドットを配置します。完了したら、ベースライン補正されたスペクトルファイルを1つのフォルダに保存します。

次に、プロファイラー モジュールを使用してスペクトル ビニングを実行するには、[ツール]、[バッチ処理]、[スペクトル ビニング] の順に選択します。統計解析用の最終ビニングシートを生成するには、ベースライン補正されたすべてのスペクトルファイルを含むフォルダーを選択します。スペクトルを、0.01 から 0.04 ppm の範囲で定義されたスペクトル幅を持つ同じサイズのビンに分割します。

バケットのサイズと、開始 PPM と終了 PPM の値を指定します。出力ビニングシートを保存するフォルダーを選択します。スペクトル干渉を防ぐために、水と溶媒TSPに対応する化学シフト領域を除外します。

最終的なスプレッドシートでは、1 つの行にサンプル名が表示され、他の行に対応する PPM を持つビン値が表示されます。統計分析を実行する前に、正規化、対数変換、およびパレートスケーリングを使用してデータを正規化します。多変量解析では、主成分分析、偏最小二乗判別分析、および直交偏最小二乗判別分析を実行して、グループ間の識別を観察し、代謝プロファイルの違いに関与するすべての代謝物の投影スコアの可変重要度を生成します。

スチューデントのt検定を実行して、p値が0.05未満の有意な代謝物を特定します。T検定では、代謝物濃度の違いを示すボックスウィスカープロットが作成されます。次に、バイオマーカー解析を行い、レシーバー動作特性曲線グラフの下の面積を生成します。

予測スコアの変数重要度が 1 より大きい、ボンフェローニ補正された p 値が 0.05 未満、および曲線下面積が 0.8 より大きいことに基づいて、有意な代謝物の最終リストを選択します。ヒトメタボロームデータベースを使用して、特定のPPM値に対応する代謝物を同定します。定量を開始する前に、プロセッサーモジュールを使用して、研究用に選択した参照化合物をキャリブレーションします。

「Calibrate Chemical Shift Indicator」オプションをクリックし、参照化合物の濃度を入力します。ソフトウェアピークをスペクトル基準ピークにドラッグし、その高さと幅を調整します。スペクトル基準ピークがソフトウェアのピークと揃ったら、[Accept]をクリックします。

次に、プロファイラーモジュールで目的のスペクトルを開き、研究に適した化合物ライブラリを選択します。画面下部に代謝物のリストが表示されます。リストから目的の代謝物を選択します。

画面の上隅にあるPPM値をクリックします。スペクトルを代謝物の特定のPPMスケールにズームインします。この時点で、2つのピークが画面に表示され、1つは記録されたデータを表し、もう1つはソフトウェアのピークを表す点線で示されています。

ソフトウェアのピークをドラッグして記録されたピークに合わせ、高さと位置を一致させるように調整します。ピークが適切に整列したら、Concentration in millimolar(ミリモル単位の濃度)という見出しの下に表示された値から代謝物の濃度を読み取ります。出力ファイルを生成するには、[ツール]メニューで[バッチ操作]オプションをクリックし、出力ファイルを保存する目的のフォルダを指定します。

主成分分析では、軽度と中等度のARDS患者グループの間に明確なクラスタリングが示されました。直交偏最小二乗判別分析により、軽度と中等度のARDSグループの間に明確な分離が明らかになり、代謝の違いが強調されました。学生のt検定とバイオマーカー分析により、軽度から中等度のARDSの間で主要な調節不全の代謝物が明らかになりました。

乳酸とイソロイシンは、ARDSの重症度と相関する有意に調節不全の代謝物として同定されました。.