2D-TAUゲル電気泳動によるヒストンプロテオフォームの解明
2024年10月18日
この方法は、ヒストンプロテオフォームの特性評価と調査のためのシンプルで迅速な戦略を示しています。
私たちの取り組みは現在、エピジェネティックな変化と代謝の再配線との間の既存の相関関係をより良く特徴付けることに焦点を当てており、最終的には新しいエピジェネティックな治療標的を特定することを目標としています。エピジェネティックな修飾の動的で可逆的な性質を考えると、最近、いくつかのエピドラッグ剤が開発され、がん治療の改善と化学療法抵抗性の減少につながっています。近年、最新の質量分析法の応用と、トップページや高速液体クロマトグラフィーなどの分離技術の組み合わせにより、インスタンスの特性評価の分野で大きな進歩が見られました。
ヒストンの特性評価における主な課題は、動的修飾酵素と代謝物の利用可能性との間のクロストークから生じる、無数のヒストンプロテオフォームの存在です。まず、ミニ垂直ポリアクリルアミドゲル、電気泳動システム用のミニTAUゲルを調製します。これを行うには、6モル尿素を15%アクリルアミドビスアクリルアミドの溶液に溶解し、1ミリリットルの超純水を室温で穏やかに攪拌して溶解します。
次に、他のコンポーネントを追加し、音量を調整します。プリセットゲルプレートにこの溶液を充填し、気泡が形成されないようにし、上部から1.5センチメートル離れます。1ミリリットルのイソプロパノールを上に加え、ゲルを平らにします。
スタッキングゲルを調製するには、尿素を6%アクリルアミド、ビスアクリルアミドに1ミリリットルの超純水で溶解します。他の成分を添加した後、ゲルプレートにこの溶液を充填し、溶液がコームの歯の半分に達するまでプレートの間に10ウェルコームを挿入します。次に、6モル尿素、5%氷酢酸、および二重蒸留水を溶解して、100マイクロリットルのTAUサンプルバッファーを調製します。
次に、凍結乾燥したヒストンサンプルを30マイクロリットルのTAUサンプルバッファーに溶解します。ミニカセットに、最終濃度5%酢酸のTAUランニングバッファーを充填します。シリンジを使用してゲルのウェルをランニングバッファーですすぎ、マイクロピペットでサンプルをウェルにロードします。
次に、電気泳動チャンバーを電源に接続し、正極を下部に配置します。時々、電源を切り、ゲルウェルをシリンジですすいで、ゲルの底面から気泡を取り除きます。ゲルプレートからゲルを取り除いた後、きれいなメスを使用して目的のレーンを切ります。
次に、ゲルレーンを15ミリリットルの0.5 Mトリス塩酸塩、pH 8.8で15分間洗浄します。ここに示す成分を使用して、15ミリリットルの平衡化バッファー1と2を調製します。次に、平衡化バッファー2を暗闇に保管します。
次に、ゲルレーンを10ミリリットルの平衡緩衝液でインキュベートし、15分間穏やかに攪拌してからデカントします。その後、ゲルレーンを10ミリリットルの平衡緩衝液2でインキュベートし、暗所で15分間穏やかに攪拌してからデカントします。次に、ここに示す組成を使用して、15%アクリルアミド分離ゲルを調製します。
ゲルプレートをセットし、長いゲルプレートの端から1.5cmのところに分離ゲル溶液を充填します。上に1ミリリットルのイソプロパノールを加えてゲルを平らにし、重合させます。ゲルが重合したら、イソプロパノールをデカントし、3 mmセルロースクロマトグラフィーペーパーを使用してウェルを乾燥させます。
ピンセットを使用して気泡を防ぎ、切断したゲルレーンを分離ゲルウェルに挿入し、トリスグリシンとSDSバッファーに0.5%低融点アガロースを使用し、5マイクロリットルの0.003%ブロモフェノールブルーを使用して、ゲルレーンを分離ゲルに密封します。ゲルプレートをカセットに入れ、トリスグリシンとSDSバッファーを充填します。ブロモフェノールブルー染料が底に達するまで、ゲルを120ボルトで泳がせます。
実行後、プレートからゲルをそっと取り出し、余分なアガロースを捨てます。まず、ヒストンサンプルに対してミニ2Dゲルトリトン酸尿素(TAU電気泳動)を行い、続いて銀染色を行います。次に、ここに示す試薬を準備します。
清潔なメスを使用して、染色したゲルから目的のヒストンスポットを取り出し、各スポットを新しい1.5ミリリットルのシリコンチューブに配置して、アイソフォームの相互汚染を回避します。250マイクロリットルの50ミリモル重炭酸アンモニウム、または50%アセトンニトロを各ゲルスポットに加え、室温のサーモミキサーで穏やかに攪拌してインキュベートします。溶液をデカントし、ゲル片が透明になるまでこのプロセスを3回繰り返します。
ゲルスポットを脱水するには、200マイクロリットルのアセトンニトロールを追加します。このステップでは、ゲル片が不透明な白に変わります。アセトンニトリルをデカントし、ゲルスポットを10分間風乾させます。
ゲル片はチューブ内で乾燥しているように見えます。次に、20マイクロリットルのトリプシン溶液またはゲル片を覆うのに十分な量を追加して、ゲルスポットを再水和します。チューブを摂氏37度のサーモミキサーで、穏やかに攪拌しながら少なくとも4時間から最大16時間インキュベートします。
三連祭壇画ペプチドを含む上清を新しいチューブに移します。ゲル片に50マイクロリットルの抽出溶液を加え、超音波水浴中で摂氏4度で10分間2回超音波処理します。追加の三連祭壇画ペプチドを含む上清を同じ新鮮なチューブに移します。
凍結乾燥機を使用して、プールした抽出ペプチドを摂氏30度で乾燥させます。凍結乾燥されたペレットがチューブ内に形成されます。次に、各チューブに15マイクロリットルの0.1%トリフルオロ酢酸を加え、摂氏25度のサーモミキサーで静かにインキュベートします。
上清をバイアルに移し、液体クロマトグラフィータンデム、質量分析分析を行います。
概要
この手法では、ヒストンのプロテオフォームを迅速かつ簡便に特性評価および解析するための戦略について解説します。ここでは、エピジェネティックな変化と代謝リワイアリングの相関関係を解明することに焦点を当てています。
研究の主要構成要素
科学分野
- エピジェネティクス
- 質量分析
- がん治療
背景
- エピジェネティックな修飾は動的であり、可逆的である。
- がん治療を改善するために、新たなエピドラッグ剤が開発されてきた。
- ヒストンのプロテオフォームは、修飾酵素と代謝物の相互作用によって生じる。
- 現代の質量分析技術により、ヒストンの特性評価が向上している。
研究目的
- ヒストンプロテオフォームを効果的に特性解析すること。
- 新規のエピジェネティックな治療標的を同定すること。
- エピジェネティックな変化と代謝との関係を探索すること。
使用方法
- 電気泳動用ミニTAUゲルの調製。
- アクリルアミド溶液への尿素の溶解。
- 分離技術を組み合わせた質量分析の適用。
- 高速液体クロマトグラフィーの使用。
主な結果
- ヒストンの特性解析において大きな進展が達成された。
- エピジェネティクスと代謝の相関に関する理解が深まった。
- がんに対する新たな治療戦略が開発された。
- 多数のプロテオフォームが存在するため、ヒストンの特性解析には困難が伴う。
結論
- ヒストンプロテオフォームの特性評価は、エピジェネティックな調節を理解する上で極めて重要です。
- 最新の技術により、エピジェネティックな修飾のより精緻な解析が可能になっています。
- 今後の研究により、エピジェネティックな変化を標的とした新しいがん治療法が開発される可能性があります。
よくある質問
産業界における重要性
ヒストンのプロテオフォームを包括的に特性解析することは、エピジェネティックな標的バリデーションのリスクを軽減し、クロマチン主導の疾患メカニズムを理解する上で極めて重要です。2D-TAUゲル電気泳動のワークフローにより、ヒストンアイソフォームの精密な濃縮とマッピングが可能となり、初期探索およびトランスレーショナルリサーチにおける予測の信頼性が向上します。この能力は、エピジェネティック修飾に関するポートフォリオ決定や治療仮説の検証において不可欠です。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期発見および標的バリデーション
- ヒストンのPTMパターンの解析を可能にし、エピジェネティックな制御経路を明らかにします。
- 疾患状態に関連するプロテオフォーム特異的な修飾を区別することで、生物学的なリスク低減をサポートします。
- 新規のヒストニン型を単離および特性解析することで、機能的なターゲットバリデーションを促進します。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- ダウンストリームの質量分析およびウェスタンブロットワークフローに向けて、高分解能のヒストンサンプルを調製します。
- プロテオフォームの直交分離を可能にすることで、アッセイの再現性と標準化を向上させます。
- PTMの存在量の定量分析を可能にし、スクリーニングキャンペーンにおける信頼性の高い化合物評価をサポートします。
トランスレーショナル・前臨床研究
- ヒストンPTMプロファイルを疾患関連モデルと照合し、バイオマーカーの探索に役立てます。
- 発見段階のプロテオフォームマッピングから、エピジェネティック介入の前臨床検証までの連続性を提供します。
- PTMと表現型のアウトカムとの間のメカニズム的な関連性を明らかにすることで、トランスレーショナルリサーチにおける推進のリスクを低減します。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は、リード化合物の同定やトランスレーショナル研究に先立って、ヒストンプロテオフォームの高解像度マッピングを可能にすることで、創薬探索から前臨床研究への一連の流れに統合されます。
- 探索生物学：詳細なPTM解析を通じて、仮説検証およびパスウェイの解明をサポートします。
- スクリーニング：再現性のあるダウンストリーム解析に向け、アッセイ可能な十分に特性解析されたヒストンサンプルを提供します。
- 分析：条件間の比較解析のために、質量分析に対応した定量的なアウトプットを提供します。
- トランスレーショナルリサーチ：プロテオフォームマッピングを、疾患モデルの検証およびバイオマーカーの整合性に結びつけます。
- エンタープライズ再利用：各プログラムにわたるヒストンPTM特性解析のための、堅牢で再利用可能なプラットフォームを構築します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：エピジェネティックな標的バリデーションにおける予測の信頼性を向上させ、メカニズム的な曖昧さを低減します。
- 運用上の価値：プロテオフォームの濃縮および解析を標準化し、拡張可能で再現性のあるワークフローを実現します。
- 戦略的価値：十分な情報に基づいたgo/no-go判断を可能にし、エピジェネティック・プログラムの資本効率の高い推進を実現します。
- ポートフォリオへの影響：エピジェネティックな標的および介入における、リスク調整後の優先順位付けを支援します。
実施上の注意点
- ゲル電気泳動、質量分析、およびプロテオミクスのサンプルハンドリングに関する専門知識が必要です。
- 2次元ゲル分離および後続のMS分析のための専用機器へのアクセスが不可欠です。
- 再現性とデータの比較可能性を確保するため、チーム間での厳格な標準化が必要です。
- サンプルの複雑性に基づき、異なるヒストン源やモデルシステムに合わせて適宜調整が必要な場合があります。
- スループットと感度は、ゲルの解像度および質量分析装置の性能に依存します。
