比色分析によるエラスターゼ酵素活性の調節の定量化

私たちの研究範囲は、天然の反応性化合物の開発に焦点を当てています。そこで、in vitro法を用いて、エラスチンの分解や弾力性の喪失に関与する酵素であるエラスターゼの活性を評価し、組織の恒常性を回復させることを目指しています。天然植物抽出物の定量化、その活性は、主にそれらの複雑な化学組成と、一般的な測定を妨げる可能性のあるしばしば強い着色に関連するいくつかの課題を提示します。

この研究分野を前進させるためには、信頼性の高い適応型プロトコルの開発が不可欠です。私たちの研究は、シンプルさ、感度、緊張の迅速な結果、さまざまな研究ニーズへの適応性など、この分野にいくつかの利点を提供します。まず、分析天びんを使用して適切な量のトリスベースを計量し、計量したトリスベースをビーカーに移します。

メスシリンダーを使用して、脱イオン水をビーカーに加えます。トリスベースが完全に溶解するまで、マグネチックスターラーで溶液を攪拌します。次に、4つの正常塩酸を使用して溶液のpHを8に調整します。

目的のpHに達したら、溶液をメスフラスコに移します。脱イオン水を使用して、フラスコをマークされた容量まで満たします。調製したバッファーをラベル付きの保存ボトルに移し、室温で保存します。

サンプル調製では、分析天びんを使用して必要な量のサンプルを正確に計量します。調製した反応バッファーにサンプルを溶解して、目的の濃度にします。ボルテックスミキサーを使用して、サンプルを完全に溶解します。

そして、準備したサンプルを氷上に保存します。次に、反応緩衝液中のエラスターゼ酵素の作業溶液を最終濃度10マイクログラム/ミリリットルまで調製します。使用する準備ができるまで、エラスターゼ溶液を氷の上に保存します。.

次に、反応バッファーに0.8ミリモルのSANA溶液を調製します。溶液を光から保護し、使用するまで摂氏4度で保管してください。フッ化フェニルメタンスルホニルフッ化物、またはPMSFストックの場合、イソプロパノール中の100ミリモルPMSF溶液を調製します。

調製した溶液を氷上に保存します。すべての反応をマイクロ遠心チューブを使用して三重に調製します。すべてのチューブを室温で20分間インキュベートします。

次に、カラーコントロールを除いて、各チューブに100マイクロリットルのSANA基質溶液を追加します。チューブを数回静かに反転させてサンプルを混合し、各チューブから300マイクロリットルを96ウェルプレートに移し、各サンプルの測定を3回行うようにします。最後に、96ウェルプレートを410ナノメートルに設定されたマイクロプレートリーダーに置き、定期的に、毎分、20分間、または信号が室温で安定するまで吸光度を測定します。

抽出物1は、1、0.75、および0.5ミリグラム/ミリリットルの濃度で弱いが有意なエラスターゼ阻害活性を示し、0.25ミリグラム/ミリリットルでは有意な影響は示さなかった。抽出物2は、試験したすべての濃度で高いエラスターゼ阻害活性を示し、阻害レベルは1ミリリットルあたり0.75、および0.5ミリグラムで陽性対照と同様のでした。