Calvarial Bone Marrowにおける血管動態の生体内縦断的イメージング

この研究は、生体内顕微鏡を使用して骨髄マクロ環境における血管動態を理解することに焦点を当て、血管が正常および病的な造血にどのように反応するかを明らかにすることを目的としています。私たちは、写真顕微鏡、トランスジェニック動物モデルなどの高度なイメージング技術を使用し、トレーサーを分析して、生体組織の動的な血管変化を経時的に視覚化および定量化します。重要な進歩は、動物福祉を改善し、3 つの R に沿ったプロトコルの改良です。私たちの縦断的アプローチは、手術手順を最小限に抑え、研究に必要な動物の数を大幅に減らします。

私たちのプロトコルは、深部組織への浸透と細胞の挙動と相互作用の高解像度の視覚化を可能にする2光子顕微鏡を使用することにより、無毒で長期の生体内イメージングのニーズに対応します。3D プリントされた頭部インプラントを使用すると、高さ、角度、順序を変更することなく、縦方向のイメージング セッション中に関心のある領域を非常に簡単に見つけることができます。私たちは現在、このプロトコルを使用して、特定の内皮サブタイプと、白血病の発症および薬物治療に対するそれらの反応を追跡し、疾患の病因に対するそれらの寄与をより深く理解しています。

まず、セグメンテーション ソフトウェアを起動し、micro-CT DICOM ファイルをインポートして頭蓋骨を分離します。しきい値ベースのセグメンテーションを実行して、骨組織を周囲の構造から分離します。複雑な領域やノイズの多い領域を手動で調整して、セグメンテーションを微調整します。

3D スライサーで、DICOM ファイルをインポートし、データセットを読み込みます。軸方向、矢状方向、および冠状方向のスライスビューでCTスライスを観察します。セグメントエディターを開き、「追加」をクリックして新しいセグメント化を作成し、もう一度「追加」をクリックして、しきい値設定用の新しいセグメントを作成します。

セグメントエディタパネルで、しきい値効果をクリックします。しきい値の下限と上限のスライダーを調整するか、数値を入力して、セグメント化された領域を赤で強調表示します。セグメント化された頭蓋骨を stl ファイルとしてエクスポートするには、セグメント化モジュールに切り替えます。

しきい値セグメントが選択されていることを確認します。モデルとラベルマップのエクスポート/インポートセクションで、エクスポートタイプをモデルに設定し、ファイル形式をstlに設定し、エクスポートをクリックしてファイルを保存します。CADで頭蓋骨モデルを準備するには、まず、stl形式の簡略化された頭蓋骨モデルを新しい部品またはモデルとしてCADソフトウェアにインポートします。

正中平面に、頭蓋骨に接する軸を作成し、準備した頭蓋骨モデルを保存します。頭蓋骨平面にスケッチを作成し、AP プラス 6.5 からマイナス 2 までの洋ナシ型のスプラインをデザインします。AP 0.0で幅が6ミリメートルの場合、これが観測可能な表面の輪郭になります。

インプラントの尾部を設計し、利用可能な体積を尊重しながら適切な固定のために頭蓋骨の構造に適合するようにします。最後に、使用しないときに観察窓を保護するための保護カバーを作成します。麻酔をかけたマウスを摂氏37度に設定された加熱パッドの上に置き、呼吸数を目視で監視します。

電気カミソリでマウスの頭を剃ります。次に、マウスの目に点眼用ジェルを一滴塗ります。画像アーチファクトを防ぎ、創傷感染のリスクを軽減するために、すべての毛が必ず除去されていることを確認してください。

次に、滅菌鉗子とはさみを使用して頭皮の中央部分に小さな切開を行い、中央の骨の傷跡を露出させます。頭蓋骨と頭皮の間の結合組織を取り除きます。ペトリ皿に十分な歯科用セメントを混ぜてペーストを作ります。

頭部固定インプラントの底面に素早く塗布します。歯科用セメントが画像領域に入るのを許さず、露出した頭蓋骨にヘッドホルダーを置き、固まらせます。顕微鏡の定位マスクに向かうイソフルランの流れをオンにします。

次に、マウスを顕微鏡にすばやく持っていきます。マウスの歯をマスクに慎重に挿入し、片手で鼻を持ち上げてイソフルランが適切に浸透できるようにします。片手でマウスを持ちながら、もう一方の手で頭部固定インプラントのアリ溝を固定ホルダーにそっと滑り込ませます。

ネジつまみを半回転させて固定します。次に、マウスの温度を監視するために、水性ゲルが事前に埋め込まれた直腸プローブを導入します。ヘッドイメージングチャンバーに大量の水性ゲル(PBS)を充填します。

水浸対物レンズを完全に浸すまで下げて、2光子励起中の最適な励起と信号検出を実現します。x、yステージ、zドライブを動かして、足場瘢痕の中央の骨に焦点を合わせます。骨表面と中心静脈でマークされた組織を特定します。

部屋の照明を消し、顕微鏡スタンドの周りの箱を閉めます。非TOSCAN検出器を作動させた後。PMT1は、423〜461ナノメートルで2番目のSHGを検出するように設定し、485〜548ナノメートルでGFPを高D2、551〜645ナノメートルでTD D'Amatoを高D3に設定します。

オフセットはゼロのままにします。次に、PMT SHGゲインを850ボルトに設定し、高いDゲインを100%に設定します。3つのチャンネルのうち最も低いチャンネルで200グレーレベルのダイナミックレンジの画像が表示されるまで、赤外線レーザー出力を上げます。取得ソフトウェアでは、骨髄ポケットを含むロケーター領域が骨表面内に包まれていることを示します。

さまざまな関心領域 (ROI) を特定するには、損失ナビゲーターをアクティブにし、スパイラル モードを使用して概要を作成します。単一の画像アイコンをクリックして、選択したROIポジションを記録し、タスクリスト内の各ポジションの名前を変更します。Zスタックボリュームを取得するには、Zスタックモードを選択し、ステップサイズを3マイクロメートルで定義します。

すべての領域で同じスタックサイズオプションの選択を解除し、開始を押して開始し、終了を押して終了します。キャプチャー後、「スタックの再定義」をクリックします。開始を押して画像収集を開始し、適切なフォルダーに画像を保存します。

血管透過性などの動的特徴を測定するには、取得モードをXYZTに変更してタイムラプスを取得します。T モジュールで、時間間隔を 3 分に、期間を 1 時間に調整します。次に、100マイクロリットルの70キロダルトンデキストランTRITCを1ミリリットルあたり4ミリグラムの濃度で静脈内注射し、取得を開始します。

マウスを摂氏37度の加熱パッドの手術マークに移した後、部位内ジェルを頭蓋骨に塗布して水分を保ちます。ヘッドインプラントのイメージング領域を特定のカバーで閉じ、カバーをネジで慎重に固定します。マウスを摂氏37度に設定した加熱ボックスに入れ、目覚めるのを待ちます。

マウスが完全に回復したら、動物施設に運び、ハイドロゲルと環境を濃縮した清潔なケージに収容します。縦方向の取得の場合は、ヘッドホルダーがすでに取り付けられているマウスの目に点眼用ジェルを少量垂らします。前に示したように、概要画像を取得します。

必要に応じて、画像のロードと整列モジュールを使用して、以前の画像と新しい画像を再配置します。画面キャプチャ画像を開き、元の位置に位置をマークします。チタン製頭部固定インプラントのCADモデルは、頭蓋骨の解剖学的構造に適合するように設計されており、細胞レベルのイメージングのために顕微鏡ステージに安定した取り付けを保証します。

インプラントはマウスの頭蓋骨への取り付けに成功し、マウスが通常の活動を維持できるようにしながら、長期にわたって安定したイメージングを可能にしました。頭蓋骨髄血管系はタイルスキャンを使用して視覚化され、細動脈、移行毛細血管、および正弦波の複雑なネットワークが明らかになりました。定量的血管分析により、血管構造のセグメンテーションが実証され、血管の直径、長さ、真直度、およびそれらの相関関係の測定が可能になりました。

縦断イメージングは、白血病の進行中の頭蓋骨血管系の進行性リモデリングを捉え、時間の経過とともに血管密度の増加が観察されました。血管透過性を動的に評価し、時間の経過に伴う蛍光色素の異なる保持を示し、異なる骨髄血管の異なる透過性を示しました。