Name: Attine Ants Gardensの微生物叢:走査型電子顕微鏡による微生物の風景の可視化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-04T14:50:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: 学ぶ、走査型電子顕微鏡を用いてAttineアリの菌類庭園における微生物叢の構造とバイオフィルムの相互作用を可視化する方法。生態系ダイナミクスの理解に役立つ最適化プロトコルです。

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<meta charset="utf8"></head><body> 真菌増殖型アリ培養物における微生物群集のマイクロスケールSEM分析

生態系は、特定の地理的位置(つまり、環境)のプロセスによって相互接続された生物で構成されています。生物は時間の経過とともに環境と相互作用し、そこから複雑で不均一な空間パターンが出現します。空間パターニングは、生態学的な多様性と安定性を決定し、最終的には生態系の機能を決定します1,2,3,4。湿地、サバンナ、サンゴ礁、乾燥生態系などのマクロスケールの生態系では、空間パターンは資源の流れと集中と相関しています。資源の最適化、空間的な不均一性、パターニングを可能にすると、均質な生態系よりも回復力のある生態系が実現します2。生物の空間的局在化が群集生態学の基礎にあることは、微生物の世界にも翻訳されます。
微生物生態系は、微小生息地全体にランダムかつ均一に混合された生物から遠く離れており、その機能の多くを定義する空間パターンを示しています5,6,7。ウィノグラードスキーのカラムから環境および宿主に関連する微生物叢まで、これらの生態系は空間的に不均一に組織化されており、空間的な配置によって異なる表現型の応答が引き起こされます。同棲している種は、相互作用し、互いの生理機能に影響を与える可能性が高くなります。したがって、コミュニティの空間構成は、その構成自体以上に、生態系の特性と生態学的ニッチを区切っています5,7,8。これらの概念を説明すると、空間パターンの変化は、歯垢、虫歯、歯周病9,10、炎症性腸疾患11、嚢胞性肺感染症、慢性創傷感染症12,13、結腸直腸癌、および腺腫14の病理学的進行と相関しているように思われる。
微生物生物地理学(ミクロスケールでの空間と時間にわたる生物多様性の分布とパターン化の研究)の範囲の下で、微生物生態系の知識は、その空間パターンを理解することによって大いに恩恵を受ける6,13,15,16,17。私たちは、カリスマ的な菌類を育てるアッティネアリ(膜翅目:Formicidae:Myrmicinae:Attini:Attina)のコロニーの中心に見られる、昆虫が構築した微生物生態系の空間パターンを調べました。Leucocoprinae(Basidiomycota:Agaricaceae)またはPterulaceae科(Basidiomycota:Agaricales)18,19,20,21,22の担子菌を中心とした「微生物の庭」があります。庭は、アリが取り込む主に植物ベースの基質を代謝することによって成長する菌糸の絡み合ったメッシュから出現する海綿状の構造です(図1)。これらには、アティーネ属によれば、乾燥した植物の部分、昆虫の破片と死体、切りたての葉、種子、花の部分が含まれます23,24。外部の草食性の腸に類似して、庭は酵素的および化学的に難治性のポリマーを不安定な栄養資源に変換し、アリに必須アミノ酸、脂質、および可溶性糖を提供します21,25,26,27,28。
葉を刈るAtta属とAcromyrmex属の庭で実施された超微細構造、酵素、およびトランスクリプトーム分析は、これらの環境が基質分解と栄養パッチ26,29,30,31,32の連続体を構造化していることを示唆しています。庭の若い部分は、断片化された後に新しく組み込まれた基質のために暗くなる傾向があります。これらの最近追加された基質は、多くの場合、アリの働きアリの働き者によって切断され、菌糸体の塊が接種された端からコロニーを形成します。切断された端から放射状に広がる真菌菌糸は、基質29,32,33上に広がった。菌糸の存在量は、基質の分解が進行するにつれて増加し、白っぽく代謝活性な領域30,31,32をもたらす。より劣化した基質と豊富な微生物叢29,32を持つ古い地域は、茶色がかった色調とより高い湿度を示す傾向があります。労働者はこの領域の断片を取り除き、それらを廃棄物の山に分離し、そこで真菌共生生物34,35,36に害を及ぼす基質も取ります。廃棄物の山は、庭から物理的に切り離されていますが、豊富な微生物叢29,32,37,38,39による継続的な基質分解と栄養素循環のスポットです。
エンテロバクター、クレブシエラ、パントエア、シュードモナス、セラティアを主成分とする微生物叢も園内に生息しており、多様な菌類養殖システムと共有されているようです。真菌代謝を補完する可能性のある代謝経路をコードする微生物叢は、庭の生理学的応答40,41,42,43,44に関与している可能性があります。メタゲノムデータは、微生物叢がそこに存在したことを示しただけでなく、葉切りアリの菌類養殖の走査型電子顕微鏡(SEM)分析でも、主に植物基質上の棒状の細菌が示された32。バクテリア(セルロース分解株を含む)は庭全体から分離されましたが、それらは庭の古い部分と廃棄物の山、およびファウンドレスクイーン29,32によって運ばれた最初のペレットでのみ視覚化されました。また、微生物叢がin vivo(すなわち、庭や廃棄物)でバイオフィルムを形成できるかどうかも不明であり、その代謝能力42およびin vitroで観察された44から示唆されている。
ここでは、SEMを使用して、園庭地域全体の微生物叢の空間構成をさらに理解し、微生物叢と基質、および微生物叢と菌糸の物理的相互作用を詳細に説明しました。SEMは、より大きな焦点深度の画像を提供することにより、3次元の微視的構造を高解像度で観察することを可能にし、庭の微生物叢の空間パターンを徹底的に分析することを可能にします。このような不均一で繊細な真菌ベースのサンプルを固定、脱水、乾燥、スパッタコート、およびイメージングする手順について詳しく説明します。四酸化オスミウム(OsO4)を使用した固定後ステップを省略し、脱水時間を短縮することにより、SEM分析用の庭および廃棄物サンプルを準備するためのプロトコル32,33,45を簡素化しました。この適応プロトコルは、菌糸の構造パターン、微生物叢およびバイオフィルムの空間構成を保持し、他の繊細な微生物生態系およびバイオフィルムに適用できる可能性があります。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67334/67334fig01v2.jpg"> 
図1:アティーネ微生物園。 庭は、アリが取り込んだ主に植物ベースの基質を代謝することによって成長する菌糸の絡み合ったメッシュから生じるスポンジのような構造です。また、庭には微生物叢があり、真菌の代謝を補完する可能性のある代謝経路をコードしています。メタゲノムデータと以前の走査型電子顕微鏡分析では、その存在が示されていましたが、その空間構成や基質および真菌菌糸との物理的相互作用についてはほとんど知識がありませんでした。私たちはSEMを用いて、微生物叢とバイオフィルムの空間構成とパターニングを明らかにしました。マリアナ・バルコトによるイラスト(バルコトとロドリゲス 94から適応された庭園と微生物叢)、およびマリアナ・バルコトとエンツォ・ソレンティーノによる写真。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67334/67334fig01largev2.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

<table><tbody><tr><td>2 mLチューブ</td><td>Axygen</td><td>MCT-200-C-BRA</td><td>サンプルを固定および脱水するには</td></tr><tr><td>塩化カルシウム無水</td><td>メルク</td><td>C4901</td><td>CaCl2 無水物 カルノフスキーを調製するためにs 固定剤</td></tr><tr><td>臨界点乾燥機</td><td>ライカ</td><td>EM CPD 300</td><td>臨界点乾燥用</td></tr><tr><td>両面カーボン導電性テープ、12 mm (W) X 5 M (L)</td> <td>電子顕微鏡科学</td><td>77819-12</td><td>サンプルの取り付け用</td></tr><tr><td>昆虫学的鉗子</td><td>特定のサプライヤー</td><td></td>なし <td>庭のサンプルを操作するには</td></tr><tr><td>エチルアルコール (=エタノール)、純粋 (&ge;99.5%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459836</td><td>脱水</td></tr><tr><td>鉗子</td>用 <td>特定の供給者</td><td></td>なし <td>庭のサンプルを操作するため</td></tr><tr><td>ガラスビーカー</td><td>特定の供給者</td><td></td>なし <td>脱水用</td></tr><tr><td>ガラスペトリ皿</td> 特定の<td>供給者</td><td></td>なし <td>庭のサンプルを操作するため</td></tr><tr><td>ガラスピペット</td> 特定の<td>供給者</td><td></td>なし <td>サンプルを固定および脱水するために</td></tr><tr><td>グルタルアルデヒド(水性グルタルアルデヒドEMグレード25%)</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>16220</td><td>Karnovsky'を準備するには固定剤</td></tr><tr><td>の金ターゲット&nbsp;</td><td>テッド・ペラ社</td><td>8071</td><td>金塩酸でスパッタリングコートするには</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320331</td><td>溶液のpHを調整するため</td></tr><tr><td>画像エディタ</td><td>フォトショップ</td><td>任意のバージョン</td> 画像<td>を調整するには</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド(パラホルムアルデヒド 20%水溶液 EMグレード)</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>15713</td><td>Karnovsky' を準備するには固定剤</td></tr><tr><td>プロピレンレシピエン</td>ト <td>特定の供給者</td><td></td>なし <td>生きているアリのコロニーを維持するため</td></tr><tr><td>走査型電子顕微鏡</td><td>JEOL&nbsp;</td><td>IT300 SEM</td><td>サンプルイメージング用&nbsp;</td></tr><tr><td>カコジル酸ナトリウム三水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0250</td><td>カコジル酸ナトリウム緩衝液の調製用</td></tr><tr><td>スパチュラ</td><td>特定の供給者</td><td></td>なし <td>庭のサンプルを操作するため</td></tr><tr><td>直径15mm×高さ10mmの試料容器</td><td>テッド・ペラ社</td><td>4591</td><td>臨界点乾燥用</td></tr><tr><td>スパッタコーター</td><td>バルテック&nbsp;</td><td>SCD 050</td><td>金</td></tr>ス<tr><td>タブ(アルミマウント、フラットエンドピン)12.7 mm x 8 mmでコーティングするには&nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>75520</td><td>サンプルの取り付け用</td></tr></tbody></table>

attine ants' gardensの微生物叢:走査型電子顕微鏡による微生物の風景の可視化

Microbiota of Attine Ants' Gardens: Visualizing a Microbial Landscape by Scanning Electron Microscopy

ここでは、真菌菌糸、基質、微生物叢、バイオフィルムなど、アティーネガーデンおよび廃棄物サンプルの成分を視覚化するための簡略化されたプロトコルを提示しました。SEMは、庭と廃棄物が微生物叢の構造パターンをどのように足場にするかについての理解を深めました(図3)。アティーネガーデンでは、真菌菌糸は基質表面の一部を覆う枝のような構造です。真菌菌糸は脱水や破裂に非常に敏感である傾向があるため、ユーザーは菌糸の側面に導かれてサンプル調製の結果を評価することができます。以前の作品32,33,45でも観察されたように、菌糸は管状の側面を示しています。無傷のチューブ状の菌糸は、効果的なサンプル調製を示しています(図3Aおよび図4C)。菌糸がリボン状の場合、このような平坦化はおそらく技術のアーティファクトです(図4C)。
植物の基質表面は、クチクラ層と表皮層、および気孔と毛状突起によって認識される場合があります。このような構造は、基質がまだ真菌菌糸と微生物叢によってコロニーを形成していない場合に、より認識しやすくなります(図3A および 図4C)。基質がコロニー形成されると、微生物叢および/または真菌の菌糸がその表面を覆い、特定の植物構造が容易に識別できなくなります(図3A)。微生物叢は、真菌の菌糸または基質のいずれかにコロニーを形成する可能性があり、これらはそれぞれ一見異なる空間構成で形成されます。 図3では、このような空間パターンを概略的に示し、それらが識別されたそれぞれのSEM画像にボックス化しました。これにより、SEMの結果とその解釈との関連性が促進される可能性があります。
菌糸コロニー形成微生物叢はあまり一般的に観察されず、見つかった場合、菌糸表面に単離または小さなグループで発生する桿体細胞または球菌細胞で構成されています。バイオフィルムのエキソ多糖マトリックス(EPS)は、「レース生地」構造のように見えますが、小さな塊で菌糸を取り囲むことが観察されます(図3A)。かなり一般的なのは、基質にコロニーを形成する微生物叢で、さまざまなアティーネアリ種の庭で見られます。コロニー形成パターンは、基質の劣化段階によってある程度定義されるようです。したがって、微生物叢は、まだ分解されていない基質にコロニーを形成しながら、個々の細胞として発生するか、または小さなグループに集まる可能性があります。微生物叢は、微細な劣化の兆候を示す場合(つまり、植物のクチクラ/表皮層や他の植物構造が識別できず、溝やくぼみが多い場合)に基質を層状にすることがあります。
これらの「微生物マット」では、EPSマトリックスが存在しないときに細胞の形態がより認識しやすくなります。EPSマトリックスに微生物細胞が埋め込まれている場合、その形態は容易に区別できません。その空間構成に従って、バイオフィルムを「スプレッド」または「3次元」として特徴付けました。バイオフィルムが広がると、微生物細胞とEPSマトリックスが断続的に基板表面を覆い、細胞の厚さが1〜3個分の平らな層を形成します(図3B)。バイオフィルムが3次元の場合、微生物細胞とEPSマトリックスが積み重なり、数個の細胞の厚さのクラスターが形成されます。劣化した基質(古い庭や廃棄物など)によって構成された庭の領域は、微生物叢をその溝やくぼみに保護し、そこで微生物叢は厚いコミュニティを形成します(図3C)。特に、廃棄物サンプル中の広範囲に分解された基質には、すべての地域の中で最も形態学的に多様な微生物叢が大量に存在しています。酵母は、バイオフィルムを介して原核生物と物理的に相互作用し、このコミュニティにさらに複雑さを加えます。 Atta sexdens および Acromyrmex sp.廃棄物サンプルでは、EPSマトリックスが、棒状および球状の原核生物、ならびに紡錘状酵母および球状酵母を取り囲む顕著な繊維状メッシュワークを形成していることが観察されました(図3C)。
菌糸の絡み合ったメッシュから生じる、庭の海綿状の構造は、サンプルをより均一にコーティングするために追加のスパッタリングを必要とします。このようなステップにより、画像を歪め、解像度を阻害する電子散乱を回避できます(図4A)。サンプル調製ステップは、庭の構造の大部分を保持し、微生物叢の空間分布と組織を明らかにしました。ただし、真菌菌糸やEPSマトリックスなどの構造は脱水に非常に敏感であり、特にSEMの場合、保存が非常に難しいことを繰り返す価値があります。菌糸の構造は比較的よく保存されていましたが、一部の庭のサンプルで視覚化されたバイオフィルムには、EPSマトリックスの構造成分が欠けている可能性があると考えるのが妥当です。微生物叢を囲む滑らかな多糖類の最外層は一部のサンプルで保存されていましたが(図3A、B)、一部のサンプルには微生物叢の形態学的特徴は保存されていましたが、EPSマトリックスはありませんでした。しかし、EPSマトリックスが本当に存在しなかったのか、それともサンプル調製中に除去されたのかは明らかではありません。
一方では、バイオフィルムの滑らかな層を取り除くと、正確なバイオフィルム構造の理解が損なわれます。一方で、その層の下に住む細胞の形態や空間構成、物理的相互作用を明らかにすることが私たちの主な研究テーマです。以前の研究では、四酸化オスミウム(OsO4)蒸気を主要な固定剤として採用することにより、真菌菌糸とバイオフィルムマトリックスの両方の保存が報告されています44,50,51,52,53,54。次に、新鮮な庭のサンプルをOsO4蒸気で固定する比較実験を行いましたが、これは明らかにバイオフィルムの滑らかな側面を保持しています(図4B)。しかし、この方法では、菌糸と微生物叢が広範囲に平坦化されました。この平坦化は、前に説明した庭の一般的な空間的側面の喪失をもたらしました29,33,32,45したがって、庭の構造パターンに関するさらなる研究を制限しました。OsO4による固定は、微生物の形態と分布を区別すること、および細胞構造を技術的な人工物と区別することの両方を困難にし、データの解釈を複雑にしました。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67334/67334fig03v2.jpg"> 
図3:微生物叢のアーキテクチャパターン。 微生物叢は、真菌の菌糸と基質のいずれかに明確な空間組織でコロニーを形成します。このような空間パターンは概略的に示され、それらが同定されたそれぞれのSEM画像で囲まれました（(図では白い四角で区切られています):(A)ハイフコロニー形成微生物叢は、単離された細胞群または小群の細胞から構成され、一部のサンプルではバイオフィルムのエキソ多糖マトリックスが検出されます。(B)基質にコロニーを形成する微生物叢が基質全体に広がり、EPSマトリックスが細胞を覆っているため、その形態は容易に区別できません。(C)基質コロニー形成微生物叢が3次元グループを形成し、モノまたはマルチモルフォロジーバイオフィルムを構成し、場合によってはEPSマトリックスを証明します。イラスト:マリアナ・バルコト略語:EPS = exopolysaccharidic matrix。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67334/67334fig03largev2.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67334/67334fig04v2.jpg"> 
図4:無駄なイメージング。 低品質の画像で効果のない結果が得られたり、建築パターンの解釈が妨げられたりします。(A)電子散乱は画像を歪め、その解像度を妨げ、その結果、形態の識別を妨げます。これは、スパッタコーティングされたサンプルで頻繁に観察され、追加のコーティングによって減少しました。(B)四酸化オスミウム(OsO4)蒸気を一次固定剤44,50,51,52,53,54として新鮮な庭のサンプルを固定すると、バイオフィルムの滑らかな側面が明らかに保存された。しかし、それは広範囲にわたる菌糸と微生物叢の平坦化を引き起こし、庭の建築パターンに損害を与えました。(C)Karnovskyの固定液を使用したサンプル調製は、OsO4を使用した調製と比較して、菌糸構造、微生物叢分布、および庭園の空間パターンのほとんどを保持し、高品質の画像をもたらしました。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67334/67334fig04largev2.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

Attine Ants' Gardensの微生物叢:走査型電子顕微鏡による微生物の風景の可視化

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