マウス心血管リモデリングのマルチモーダル研究:4次元超音波および質量分析イメージング

当研究室では、前臨床超音波イメージングを用いて、様々な疾患や生理状態における心血管バイオメカニクスを研究しています。また、質量分析イメージングを使用して、心血管組織や脳組織における脂質の空間分布を研究しています。私たちは、組織のどこで機能的および分子的な変化があるのかを調べようとしています。

組織学や免疫組織化学などの一般的な分子イメージング技術は分子データを得ることができますが、現在利用可能な染色剤や抗体によって制限されます。一方、質量分析イメージングは、組織の空間的完全性を維持しながらもマルチオミクス研究のためのノンターゲットアプローチです。私たちの技術により、マルチオミクスを脂質、糖鎖、ペプチドにまで拡大し、これらを超音波などの機能イメージング技術と組み合わせることができます。

これらの技術により、研究者は機能イメージングと分子イメージング技術を組み合わせることができるようになりました。私たちの研究室では、心血管疾患について主に2つの分野に注力しており、そのうちの1つは心臓発作やがん治療による心臓リモデリング、つまり心毒性について研究しています。そして、私たちの2つ目の大きな心臓血管の目標は、老化と老化が血管系にどのように影響するかを調べることです。

心臓の4次元超音波検査を行うには、マウスをイメージングプレート上の仰臥位に置きます。次に、トランスデューサーをホルダーのセミロック位置に置きます。トランスデューサーの隆起したドットを画面上の青いドットに合わせ、マウスの右側に配置します。

トランスデューサーを回して、マウスの矢状面に沿って位置合わせし、隆起したノッチが尾側を向くようにします。胸腔の腹面に超音波ゲルをたっぷりと塗布して、トランスデューサーと音響結合します。トランスデューサーが超音波ゲルに接触するまで下げます。

プレートの基部にあるXYノブで微調整を行い、微調整を行います。次に、画面上の胸骨周囲の長軸ビューに、頂点、左心室流出路、大動脈が水平に配置され、正確なイメージングのために配置されていることを確認します。画面の下隅にある[画像に名前を付け]を選択して、画像を現在のシリーズに保存します。

探触子を時計回りに90度回転させて、蠟骨周囲の短軸ビューを取得します。左心室が画像で明確に定義され、乳頭筋が見えていることを確認します。画面の左上隅にある立方体のアイコンを選択して、4次元画像を設定します。

トランスデューサーをリセットした後、開始位置を頂点のすぐ下に調整し、停止位置を大動脈弓に調整します。ステップ サイズを 0.08 から 0.13 ミリメートルに、フレーム レートを 200 から 300 ヘルツに設定します。スキャンを開始する前に、バイタルサインと心電図信号が安定していることを確認してください。

スキャンと処理が完了したら、後処理のためにSave EKV/4DデータとRespiration Gatingをオンにします。右下隅にある[Name Image]を選択し、名前にマウスIDを含めます。心周期を通じて各ビュー平面を視覚化するには、[More Controls] を選択し、[Load Into Four-Dimensional] を選択します。

心臓の各平面図を見直し、心臓の中心が心周期を通じて安定していることを確認します。まず、マウス組織の瞬間凍結用のアルミホイルボートを準備します。鉗子を使用して、安楽死させたマウスの皮膚をテントで覆い、血管アクセスの場合は首の上の、心臓アクセスの場合は胸骨のすぐ下をハサミでテントで切り抜きます。

皮膚と筋肉の層を切開し続けて、血管系を露出させます。心臓の除去は、骨を切開して心臓を露出させます。綿棒による鈍い解剖を使用して、脂肪を含む周囲の組織から心臓または血管系を分離します。

頸動脈血管を神経から慎重に分離します。次に、手術器具を使用して心臓または血管系を取り除きます。頸動脈血管、心臓、血管系を事前にラベル付けされたアルミホイルボートに置きます。

次に、ボートを液体窒素に入れて急速冷凍します。まず、ビーカーにHPLC水を入れ、5ミリリットルと1ミリリットルの注射器と一緒に置いておきます。次に、クライオスタットの温度をマイナス25°Cに設定し、ブレードを挿入します。

一対の鉗子をクライオスタットチャンバー内に置き、組織をマウントする前に冷却します。5ミリリットルのHPLC水をシリンジに引き込み、クライオスタットに入れて水を部分的に凍結します。シリンジ内の水が完全に凍結する前に、金属チャックに分注し、完全に凍結させます。

次に、1ミリリットルのシリンジにHPLC水を入れ、クライオスタットに入れます。30〜60秒後、部分的に固まった水をチャックの中央に少量置きます。鉗子を使用して、抽出したマウスの心臓を水滴にすばやく置き、周囲の水が完全に凍るまでそこに保持します。

まず、マウスの心臓が取り付けられたスライドを冷凍庫から取り出し、デシケーターに入れて乾かします。HTX M3 +噴霧器の電源を入れます。ラップトップでHTXアプリを開き、メソッドで、ノズル温度を摂氏75度に、流量を毎分100マイクロリットルに、圧力を10psiに設定します。

サンプル名、極性、マトリックス、溶媒、濃度をラボノートに記録します。次に、目的の濃度に必要なマトリックス量を計算します。次に、ポジティブモードマトリックスの所望の量の2,5-ジヒドロキシ安息香酸を秤量します。

マトリックスを70%メタノールに15ミリリットルのチューブで溶解します。マトリックス溶液を10分間超音波処理します。超音波処理中に、スライドをデシケーターから取り外します。

噴霧器トレイを開きます。次に、スライドを左下隅に置き、端をテープで留めます。サンプルのスプレー領域を選択し、トレイを閉じます。

シリンジとフィルターを使用して、マトリックス溶液をシリンジに引き込みます。噴霧器の左側にある黒い蓋で、シリンジを通してマトリックス溶液をバイアルにろ過します。バイアルを噴霧器の指定された場所に戻し、Dラインチューブをバイアルにしっかりと挿入します。

次に、不活性ガスをオンにし、噴霧器のゲージが10psiを示していることを確認します。スタートを押し、噴霧器が設定温度に達したら、点滅しているスタートボタンを選択してスプレーを開始します。スプレーが完了したら、サンプルを噴霧器から取り出し、MALDIスライドホルダーに入れます。

MALDIスライドホルダーをスキャンし、スキャナーを使用してスライドします。画像をフラッシュドライブに保存して、質量分析イメージングに使用します。噴霧器で[洗浄]オプションを選択し、Dラインをマトリックスバイアルから廃棄物ビーカーに移動します。

最後に、噴霧器トレイにメタノールをスプレーし、きれいに拭きます。窒素を止めます。梗塞性心筋組織のMALDI質量分析イメージングにより、電荷577.52の分子イオン質量が同定され、CまたはDのCOHbに対応する可能性が高く、心筋リモデリングへの関与が示唆されています。

4次元超音波画像は、表面積が20%未満のひずみの大きさの心筋領域を示し、緑黄色の組織として視覚化され、梗塞領域を示しています。心筋梗塞組織の長軸図では、脂質の非局在化が見られ、組織の生体力学と分子組成との相関が複雑になりました。