浸透圧制御による Bursaphelenchus xylophilus の第3段階分散幼体のクリプトビオシスへの侵入誘導

私たちの研究は、主にマツノザイセンチュウの飛散第3期幼魚の冷感受容機構に着目し、特にマツノザイセンチュウがマイナス20度程度の低温ストレスにどのように耐えるかに取り組んでいます。現在の実験課題は脱水時間であり、これはBursaphelenchus xylophilusの第3段階の分散幼体の生存率を決定する上で重要です。時間が長ければ長いほど、強調が強くなることをお勧めします。

私たちは、Bursaphelenchus xylophilusの第3段階の分散幼体がクリプトバイオシスに侵入することで、極端な低温環境に耐えることができることを確立し、過酷な条件下での重要な生存メカニズムを強調しています。私たちのプロトコルは、マツノザイセンチュウのクリプトビオーシスを誘発し、それらを建築的に成功裏に復活させることにより、研究のギャップに対処します。これにより、それらの生存メカニズムと追加のアプリケーションの制御された研究が可能になります。

私たちのプロトコルはシンプルで信頼性が高く、マツノザイセンチュウの耐応力メカニズムを立たせるための非常に堅牢な技術サポートを提供し、他の技術と比較してよりアクセスしやすく効率的です。集めた丸太のPinus massonianaをのこぎりを使って厚さ0.5〜1センチメートルのスライスに切ることから始めます。スライスを長さ2〜3センチの小さなストリップにトリミングします。

小さな木片を密封された袋に入れ、さらに使用するために袋を実験室に保管します。直径約15センチの長いネックガラス漏斗の狭い端にゴムチューブを取り付けます。ゴムチューブをピンチコックで固定し、組み立てた漏斗を漏斗スタンドに置きます。

小さな木片をティッシュペーパーの単層で完全に包みます。漏斗に包まれた木のストリップを置き、すべての木のストリップが沈められるまで蒸留水を加え、次に漏斗の底でピンチコックをゆっくりと解放し、混合物の2000〜5、000マイクロリットルを直径5センチメートルのシャーレに漏らして顕微鏡検査と形態学的識別を行います。混合物を観察して、スタイレット、食道球状中央値、脂肪滴、指のような尾の形状などの特徴に注目して、J3 Bursaphelenchus xylophilusを特定します。

10マイクロリットルのピペットを使用して、毎回10マイクロリットルの液体と1つの線虫を吸引し、個々のJ3 Bursaphelenchus xylophilusをスライドに移します。最後に、J3 Bursaphelenchus xylophilusを抽出した後、残りの木材ストリップと感染した木材材料を滅菌して、さらなる汚染を防ぎます。まず、Pinus massonianaからJ3 Bursaphelenchus xylophilusの標本を抽出し、浸透圧調節のために8%塩化カリウム水溶液を調製します。

ピペットを使用して、J10 Bursaphelenchus xylophilusの混合物を含むスライドに8%塩化カリウム水溶液を3マイクロリットル加えます。スライドを顕微鏡ステージに置き、水が自然に蒸発するのを待ちます。J3 Bursaphelenchus xylophilusの脱水過程を顕微鏡で観察します。

体のカールや凝集などの兆候を監視します。水が完全に蒸発し、塩化カリウムの結晶が沈殿したら、線虫の動きを止めてクリプトビオシスに入るのを観察します。クリプトビオティクスJ3 Bursaphelenchus xylophilusをマイナス20°Cの一定温度環境に24時間置きます。

24時間後、ピペットを使用して、低温処理を受けた少年の周りに約300マイクロリットルの蒸留水を追加します。J3 Bursaphelenchus xylophilusの再水和過程を顕微鏡で観察します。体のストレッチや動きの再開などの兆候を監視します。