ヒト血小板における組織因子発現のフローサイトメトリー解析

このプロトコルでは、全血流サイトメトリーによる血小板関連組織因子の測定、細胞内コンパートメント内のタンパク質の評価、停止条件、および細胞表面上の、安静時および活性化時の両方でのDPを使用すると、最も一般的な血小板アゴニスト組織因子の1つが血小板のサブセットによって発現されます。組織因子陽性血小板をPRP多血小板血漿または洗浄血小板で測定すると、このサブセットがサンプル調製中に失われる可能性があります。このリスクは、この評価が壁で実行される場合は発生しません。

血液プレート関連組織因子は、今世紀初頭に発表された最初のレポート以来、事前分析的および方法論的な問題により、物議を醸してきました。このプロトコルは、これらの問題に光を当て、また、血小板関連組織因子測定または血流サイトメトリーを標準化するために、血小板関連組織因子分析または血流サイトメトリーを標準化するために、国際血栓止血学会が支援する国際プロジェクトを実施するために使用され、臨床現場に適した血小板関連組織因子分析を可能にします。さらに、サンプルを固定し、後でラベル付けすることができるため、この分析は多くの病院や研究所で実現可能になります。

まず、抗体容量ごとに1本の試験管を準備します。テストするには、各試験管にネガティブビーズ1滴とポジティブビーズ1滴を追加します。各抗体希釈液の20マイクロリットルを試験管およびボルテックスに加える。

直ちに試験管を暗所で室温で20分間インキュベートします。次に、カルシウムとマグネシウムpH 7.4を含まないPBSの1ミリリットルを各チューブと渦に加え、クエン酸ナトリウムの真空剤を5回静かに反転させて、血液と抗凝固剤を完全に混合します。50マイクロリットルの血液を1.5ミリリットルのチューブに移します。

次に、950マイクロリットルの1%パラホルムアルデヒドを追加します。サンプルを静かに混合し、室温で90分間インキュベートします。次に、サンプルを1, 500 Gで5分間遠心分離し、室温で休憩します。

上清リースを取り除いた後、ペレットをカルシウムとマグネシウムを含まない1ミリリットルのPBSに懸濁します。pH 7.4で、各チューブに100マイクロリットルの固定血液を分注し、それらを1, 500Gで5分間遠心分離します。室温で休憩し、上清のresusを取り除きます。

ペレットを0.1%Triton PBSの100マイクロリットルに懸濁してサンプルを透過し、室温で10分間インキュベートします。まず、蛍光用のチューブを1本からコントロール用1本を差し引いたものと、組織因子染色用のチューブを1本ずつ調製します。各チューブ内の100マイクロリットルの固定血および透過性全血に抗体を添加します。

カルシウムとマグネシウムを含まないPBSをpH 7.4で各チューブに300マイクロリットル加えて混合します。次に、フローサイトメトリー分析でアルファCD1 42 HTF 1モノクローナル抗体、およびAlexa Fluer 6 33ヤギ抗マウス免疫グロブリンGをカルシウムとマグネシウムを含まないPBSで希釈するまで、染色したサンプルを暗闇で保存します。次に、3つのサンプルチューブを準備し、カルシウムとマグネシウムを含まないPBSを分注します。

pH 7.4で、7.5マイクロリットルの希釈アルファCD1 42 htfモノクローナル抗体を分注し、5マイクロリットルのアデノシン二リン酸を添加します。クエン酸真空剤を5回静かに反転させ、血液と抗凝固剤を完全に混合します。各チューブに5マイクロリットルの全血を分注します。

サンプルを穏やかに混合し、室温で20分間インキュベートします。サンプル固定のために、各チューブに1%PFAの300マイクロリットルを加え、室温で休憩しながら5分間1,500Gで遠心分離します。上清が取り除かれたら、カルシウムとマグネシウムを含まない90マイクロリットルのPBSにペレットを懸濁します。

pH 7.4 で、ピペッティングで穏やかにピペッティングし、希釈した Alexa Fluer 6 33 免疫グロブリン G 5 マイクロリットルと α CD 41 PE 5 マイクロリットルを各チューブに分注します。サンプルを室温の暗所で15分間インキュベートします。次に、カルシウムとマグネシウムを含まないPBSをpH 7.4で各チューブに300マイクロリットル加えて混合します。

まず、すべてのイベントを表示する対数スケールで前方散布図領域とサイド散布図領域のドットプロットを作成し、すべてのイベントを表示する対数スケールでCD 61 Aとサイド散乱エリアのドットプロットを作成します。血小板集団を可視化するには、側方散乱高さで約2000、CP B six 90 Hあたりで1000にしきい値を設定し、毎日の品質管理に従ってPE Y 5 8 5とCP B six 90ゲインを調整し、流量を低く設定します。次に、10 光線の 3 乗と 10 光線の 5 乗の間の領域を CD 61 正と呼びます。

血小板集団を特定するには、FMO を複製し、名前を TFIC に変更します。サンプルを取得し、CD 61ポジティブゲート内の10、000イベントのデータファイルを記録します。前方散布図領域と側面散布図領域のドットプロットを対数スケールで作成し、すべてのイベントを表示します。

CD 41 Aとサイドスキャッターエリアのドットプロットを対数スケールで作成し、すべてのイベントを表示します。次に、毎日の品質管理に従って、Alexaフロア6 33ゲインとPE wifi 5 8 5ゲインを調整します。閾値を側面散乱高さでおよそ1000に設定し、PEY 5 85で2, 500に設定して血小板集団を視覚化 H.To、流量を低く設定します。

次に、10 光線の 4 乗と 10 の 5 乗までの領域を CD 41 正の値として描画し、血小板数を特定します。次に、サンプルごとにチューブを作成し、TF UnstimulatedとTF Stimulatedという名前を付けます。サンプルを取得し、CD 41ポジティブ歩行遠心分離機内の10、000イベントのデータファイルを記録します。

0.129モルのクエン酸ナトリウム真空剤を100 Gで室温で10分間休憩なしで使用しました。次に、遠心分離機からバキュテイナーを取り外します。得られた多血小板血漿を採取し、10ミリリットルのポリプロピレンチューブに移し、血球カウンターを用いて多血小板血漿中に集めた血小板を2回記録します。

α CD 61抗体染色により同定された血小板集団は、循環血小板の約26.8%が細胞内組織因子フローサイトメトリー分析を含んでいることを示し、組織因子は休止血小板の約2.8%によって発現され、アデノシン二リン酸による活性化により24.5%に増加することを示した。より大きなサイズの血小板は、より大きな血小板サブセットを表して、より高い組織因子レベルを発現することが示されました。フローサイトメトリー解析により、100 g 遠心分離法を用いて調製した多血小板血漿は、全血と同様の集団を維持し、より大きなサイズの血小板を保持し、組織因子陽性率が高いことが実証されました。

遠心分離力が高いと、PRP集団の前方散乱が減少したことで示されるように、より大きな組織因子陽性血小板が失われました。