In vitroユビキチン鎖切断アッセイによる神経発達障害関連脱ユビキチン化酵素の酵素活性の測定
2024年9月27日
このプロトコルでは、組換えタンパク質精製とユビキチン鎖切断アッセイを組み合わせることにより、神経発達障害に関連する遺伝的変異が脱ユビキチン化酵素活性に及ぼす影響を測定する方法を説明しています。
私たちは、ユビキチン系の酵素の遺伝子変異に関連する神経発達障害の分子基盤を定義することに興味を持っています。私たちは、最先端の技術を用いて、これらの酵素によって制御されるシグナル伝達経路を解剖し、遺伝子変異がタンパク質生物学に与える影響を解明しています。この方法の利点は、特定のDUBによって規制される基板に関する事前の知識を必要としない、基板に依存しない手法であることです。
このようにして、神経発達障害に関連する遺伝子分散がDUB触媒活性に与える影響を直接測定し、可能な病原性メカニズムを示唆することができます。ほとんどのDUBの細胞機能は十分に理解されていないため、私たちの研究室では、これらの酵素が媒介するシグナル伝達経路と、遺伝病に関連する遺伝子変異がこれらのプロセスにどのように影響するかを特定することに焦点を当てます。まず、使用直前に20マイクロリットルの化学的に有能なRosetta 2 Escherichia大腸菌細胞を氷上で解凍します。
pGEX6P1 USP27X発現プラスミドを1〜10ナノグラム加え、氷上で5分間インキュベートします。ドライバスで摂氏42度で細胞に30秒間熱ショックを与えます。次に、細胞を氷上で2分間インキュベートします。
80マイクロリットルの室温SOC培地を細胞に加えます。19 mm軌道ベンチトップ温度制御シェーカーで、200 RPM回転で摂氏37度で60分間インキュベートします。次に、50マイクロリットルの培養物をLB寒天プレートにプレートし、クロラムフェニコールとアンピシリンを補充します。
温度制御されたインキュベーターで、蓋を下にして摂氏37度で20時間インキュベートします。形質転換細菌のコロニーを1つ選び、クロラムフェニコールとアンピシリンを添加した10ミリリットルの滅菌LB培地に加えます。前述したように20時間インキュベートします。
次に、クロラムフェニコールとアンピシリンを補給した結核培地1リットルに、10ミリリットルの一晩培養液を加えます。600ナノメートルの光学密度が0.5〜0.6に達するまでインキュベートします。次に、50マイクロモルのイソプロピルβ-d-1-チオガラクトピラノシドを培養物に添加して発現を誘導します。
サンプルを摂氏16度に冷却した後、摂氏16度で200RPM回転で20時間インキュベートします。次に、細胞を3000G以上、摂氏4度で20分間遠心分離し、発現培養物から細胞をペレット化します。最後に、ペレットを摂氏マイナス80度で少なくとも1時間保管します。
まず、空の重力流柱をレトルトスタンドに固定します。カラムに2〜3ミリリットルのグルタチオンアガロース樹脂を充填し、1リットルの発現培養物から採取した細胞ペレットを精製します。カラムを 20% エタノールの 1 つの樹脂ベッドで洗浄します。
カラムを洗浄した後、セルペレットを摂氏4度で解凍します。解凍したペレットに30ミリリットルのMS500バッファーを加え、端から端まで穏やかに回転させてインキュベートします。次に、溶解した細胞を氷上の50ミリリットルの遠心分離チューブで超音波処理し、ピペットチップから分注したときにライセートが自由に流れるまで超音波処理します。
摂氏 4 度、 20 、 000 G 以上で 30 分間遠心分離し、上清を除去します。次に、上清をビーカーにデカントし、透明化したライセートをカラムにロードします。ライセートを重力流でカラムに流し、フロースルーを収集します。
その後、少なくとも 2 つの樹脂床容量の MS500 洗浄バッファーでカラムを洗浄し、洗浄フロースルーを 5 mL の分画で回収します。次に、各画分1マイクロリットルを100マイクロリットルのBradford試薬に加えて、タンパク質の存在を確認します。MS500 elusion buffer をカラムに通し、5 ミリリットルの溶出画分を回収して、タンパク質を回収します。
タンパク質を沈殿させるには、溶出液に2容量の4モル硫酸アンモニウムを加え、チューブが濁るまでチューブを静かに反転させます。摂氏4度、20、000G以上で30分間遠心分離します。各遠心分離後は、タンパク質ペレットを乱さずに上清を除去してください。
次に、25%グリセロールを添加したMS500バッファーにタンパク質を再溶解してから保存します。精製されたGSTタグ付きUSP27Xを、各脱ユビキチン化酵素の各時点について、10マイクロリットルの精製GSTタグ付きUSP27Xを調製します。ユビキチン鎖を添加する前に、7マイクロリットルのSDS-PAGEローディングバッファーをタイムゼロサンプルに添加して、脱ユビキチン化反応の開始を防ぎます。
各脱ユビキチン化酵素の各時点に、10マイクロリットルの酵素活性化バッファーで希釈した375ナノグラムのK63結合ジユビキチン鎖を添加します。チューブを摂氏30度でインキュベートし、7マイクロリットルのSDS-PAGEローディングバッファーを追加して各時点で停止します。4〜12%グラジエントゲルを使用してSDS-PAGEを実行します。
野生型USP27Xは、1時間のインキュベーション後にK63結合ジユビキチン鎖をモノユビキチンに切断しました。XLID-105関連分散F313V、Y381H、およびS404Nは、1時間のインキュベーション後にK63結合ジユビキチン鎖を切断しませんでした。
概要
本プロトコルでは、神経発達症に関連する遺伝的変異が脱ユビキチン化酵素活性に及ぼす影響を測定する方法について説明します。この手法は、組換えタンパク質の精製とユビキチン鎖切断アッセイを組み合わせて行います。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経発達障害
- ユビキチン系
- 脱ユビキチン化酵素 (DUBs)
背景
- ユビキチン系の酵素における遺伝子バリアントは、神経発達障害に関連している。
- DUBの細胞内機能を理解することは、疾患におけるそれらの役割を解明するために不可欠である。
- 本研究は、DUBによって制御されるシグナル伝達経路を解析することを目的としている。
- 本手法では、基質に関する事前の知識は不要である。
研究目的
- 遺伝子変異がDUBの触媒活性に及ぼす影響を測定すること。
- 神経発達障害に関連する潜在的な病原性メカニズムを提示すること。
- DUBによって媒介されるシグナル伝達経路を特定すること。
使用方法
- 組換えタンパク質の精製。
- ユビキチン鎖切断アッセイ。
- 化学的コンピテントセルであるRosetta 2 Escherichia coli細胞の使用。
- 遺伝的変異に関連するDUB活性の解析。
主要な結果
- 遺伝子変異がDUB活性に及ぼす影響の直接的な測定。
- DUBによって影響を受ける潜在的なシグナル伝達経路の同定。
- 神経発達障害の分子基盤に関する知見の獲得。
- 基質に依存しないDUB解析手法の確立。
結論
- 本研究は、神経発達障害におけるDUBsの役割を理解するための枠組みを提供する。
- 酵素活性における遺伝的変異の重要性が強調されている。
- 今後の研究では、これらの知見に基づいて治療法の探索を進めることができる。
よくある質問
業界における重要性
基質に依存しないin vitroでのユビキチン鎖切断アッセイを用いて脱ユビキチン化酵素（DUB）活性を直接測定することで、神経発達障害に関連する遺伝子変異のメカニズム的なリスク低減が可能になります。このアプローチは、ターゲットバリデーションに対する予測精度を高め、遺伝子改変が酵素活性に及ぼす機能的影響を明確にするため、神経生物学や希少疾患のパイプラインにおける初期段階のポートフォリオ選別を支援します。
バイオファーマ研究開発における戦略的活用
初期探索およびターゲット検証
- 遺伝子変異を酵素機能不全に直接的に結びつけることで、治療仮説の検証を可能にします。
- 基質の知識を必要とせずにDUB変異のメカニズム的な影響を明らかにすることで、生物学的リスクの低減をサポートします。
- 神経発達障害に関連する遺伝子の機能的なターゲットバリデーションを促進します。
- 予測精度への信頼性と、早期のポートフォリオ意思決定に活用可能なデータを提供します。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- ダウンストリームの生化学的および表現型解析に使用するための、バリデート済み組換えDUBタンパク質を調製します。
- 再現性があり、基質に依存しないリードアウトを用いて、DUB活性の定量測定を標準化します。
- DUB遺伝子ファミリー全体のバリアントの影響をスクリーニングするための、スケーラブルなアッセイプラットフォームを可能にします。
- 堅牢な酵素活性のベースラインを確立することで、信頼性の高い化合物評価をサポートします。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- 神経発達障害における分子レベルの知見を、疾患に関連するメカニズムと整合させます。
- 遺伝学的発見から前臨床モデルの選定、およびバイオマーカーの開発に至るまでの継続性を提供します。
- 分子レベルでバリアントの病原性を明確にすることで、リスク調整済みの進展決定に情報を提供します。
- ジェノタイプと機能の直接的な関係を確立することで、トランスレーショナルリサーチの進展におけるリスクを軽減します。
パイプラインおよびワークフローの統合
このユビキチン鎖切断アッセイは、遺伝子変異の同定から機能的検証および前臨床段階での優先順位付けへと橋渡しを行い、初期のディスカバリーからリード化合物同定に至る連続的なプロセスに組み込まれます。
- 探索生物学：疾患関連バリアントの文脈においてDUB触媒活性を直接測定することで、仮説検証および経路の解明を支援します。
- スクリーニング：アッセイの準備状況やバリアント間の比較に不可欠な、再現性のある定量的なアウトプットを提供します。
- 分析：明確な酵素活性測定値を提供し、条件特異的な分析や機序研究に活用します。
- トランスレーショナルリサーチ：分子機能不全を疾患メカニズムに結びつけ、バイオマーカーの整合やモデル選択を支援します。
- エンタープライズでの再利用：神経発達障害およびその他の疾患領域におけるDUBバリアントの機能評価に利用可能な、再利用可能なプラットフォームを確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：標的バリデーションにおける予測の信頼性を高め、メカニズム的な曖昧さを軽減します。
- 運用上の価値：標準化され、再現性があり、スケールアップ可能な酵素活性アッセイを提供します。
- 戦略的価値：変異の影響を早期に明確にすることで、十分な情報に基づいたGo/No-go決定と資本効率の高いポートフォリオ管理を可能にします。
- ポートフォリオへの影響：遺伝学的に検証された標的のリスク調整済み優先順位付けおよび推進を支援します。
実施上の検討事項
- リコンビナントタンパク質の発現および精製に関する専門知識が必要です。
- SDS-PAGEおよび定量タンパク質アッセイのための分析インフラへのアクセスが必要です。
- アッセイ条件およびデータ解釈について、チーム間での標準化が求められます。
- 異なるDUBファミリーメンバーやバリアントタイプへの適応が必要になる場合があります。
- in vitroの酵素活性に限定されており、細胞内コンテキストやダウンストリームへの影響は捉えられません。
