Name: In vitroユビキチン鎖切断アッセイによる神経発達障害関連脱ユビキチン化酵素の酵素活性の測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-27T14:55:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: 学ぶ神経発達障害関連の脱ユビキチン化酵素活性測定法。in vitroユビキチン鎖切断アッセイを用いて、遺伝子変異が酵素活性に与える影響を直接測定し、病態メカニズムの解明に貢献します。

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以下のプロトコルは、コンピテントセルの異なる株で発現する種々のアフィニティータグを用いた組換えタンパク質に適合させることができます。発現するタンパク質によっては、培養条件および一晩の発現条件で、発現誘導、発現時間、発現温度、およびIPTG濃度でのOD600 の最適化が必要になる場合があります。プロトコルの概要を 図 1 に示します。本試験で使用した試薬および装置の詳細は、 材料表に記載されています。
1. コンピテントRosetta 2 E. coli細胞の組換えGST-USP27X発現プラスミドによる形質転換
注:細菌培養物の無菌性を維持するために、培地容器がブンゼンバーナー炎の下で開いている場所で手順を実行してください。最適な酸素移動を可能にするために、軌道19mmから50mm、速度200rpm29のベンチトップ温度制御シェーカーで細菌培養振とうを行います。
<ol>
	<li>使用直前に、化学的にコンピテントな Rosetta 2 E. coli 細胞20 μLを氷上で解凍します。pGEX6P1-USP27X発現プラスミド(N末端グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)30 タグ付きUSP27Xをコードし、アンピシリン耐性を含む)を1-10 ng加え、氷上で5分間インキュベートします。</li>
	<li>ドライバスで42°Cで30秒間の熱衝撃。氷上で2分間インキュベートします。</li>
	<li>80 μLの室温(RT)SOC培地を加えます。19 mm軌道ベンチトップ温度制御シェーカーで、200 rpm回転、37°Cで60分間インキュベートします。</li>
	<li>25 μg/L のクロラムフェニコールと 50 μg/L のアンピシリンを添加した LB 寒天プレートで 50 μL の培養物をプレートします。温度制御されたインキュベーターで、蓋を下にして37°Cで20時間インキュベートします。</li>
</ol>
2. 発現プラスミドからの組換えタンパク質の一晩の細菌発現
注:細菌培養物の無菌性を維持するために、培地容器がブンゼンバーナー炎の下で開いている場所で手順を実行します。最適な酸素移動を可能にするために、軌道19mmから50mm、速度200rpm29のベンチトップ温度制御シェーカーで細菌培養振とうを行います。分光光度計を使用して培養OD600 を測定します。
<ol>
	<li>2 Lのバッフル培養フラスコに47.6 gのTBパウダーを0.4%グリセロールを含む超純水1 Lに加えて、1 Lのテリフィックブロス(TB)培地を準備します。オートクレーブ培地を30分間放置し、室温まで冷却します。</li>
	<li>形質転換細菌のコロニーを1つ選び、25 μg/Lのクロラムフェニコールと50 μg/Lのアンピシリンを添加した滅菌LB培地10 mLに加えます。19 mm軌道ベンチトップ温度制御シェーカーで、200 rpm回転、37°Cで20時間インキュベートします。</li>
	<li>25 μg/L クロラムフェニコールと 50 μg/L アンピシリンを添加した結核培地 1 L に 10 mL を一晩培養します (開始培養と発現培養の比率は 1:100)。19 mm軌道ベンチトップ温度制御シェーカーで、培養OD600 が0.5〜0.6になるまで、200 rpm回転で37°Cでインキュベートします。</li>
	<li>50 μMのIPTGを培養物に加えて発現を誘導し、16°Cまで冷却し、200 rpm回転させて16°Cで20時間インキュベートします。</li>
	<li>発現培養液の細胞を≥3,000 x g 、4°Cで20分間遠心分離してペレット化します。 ペレットを-80°Cで少なくとも1時間保存します。 注:この時点で、実験を一時停止し、後で(できれば同じ週に)再開できます。ペレットは-80°Cで長期間保存できます。</li>
</ol>
3. 重力流アフィニティーカラムによるタンパク質精製
注:各精製に適したレジン、結合、洗浄、溶出、および保存バッファーは、精製する組換えタンパク質によって異なります。細胞ペレット、上清、フロースルー、洗浄画分、および溶出画分からSDS-PAGEバッファーにサンプルを採取します。サンプルのSDS-PAGEおよびCoomassie染色を実施して、精製の成功を評価します。4°Cで精製を行い、氷上でフラクションを処理します。タンパク質タグの切断は、適切なプロテアーゼを使用してカラム内外で実施し、関連するプロテアーゼ特異的切断部位を標的とすることができます。
<ol>
	<li>空の重力フローカラムをレトルトスタンドに固定し、グルタチオンアガロース樹脂を充填します。2〜3mLの樹脂を使用して、1Lの発現培養物から採取した細胞ペレットを精製します。</li>
	<li>カラムを 20% エタノールの 1 つのレジンベッド容量で洗浄します。1つのレジンベッド容量のMS500バッファー(20 mMのTris pH 7.5、500 mMのNaCl、0.5 mMのTCEP)でカラムを3回洗浄します。セルペレットの調製中に乾燥を防ぐために、レジンがバッファーで覆われたままになるようにカラムを停止します。</li>
	<li>細胞ペレットを4°Cで解凍します。 融解したペレットにMS500バッファー30mL(20 mMのTris pH 7.5、500 mMのNaCl、0.5 mMのTCEP、60 mgのリゾチーム、および1つのプロテアーゼ阻害剤錠剤)を加えます。4°Cで30分間、端から端まで穏やかに回転させながら溶解します。</li>
	<li>50 mLの遠心分離チューブまたは氷上の金属ビーカーで溶解した細胞を、ピペットチップから分注したときにライセートが自由に流れるまで超音波処理します。4°Cで30分間遠心分離し、≥20,000 x g で上清を除去します。 注:ソニケーターの設定を経験的に決定します。粘性溶解物を自由流動性で透明な液体に減少させるには合計120秒で十分になるように超音波発生器を設定します。</li>
	<li>上清をビーカーにデカントし、透明化したライセートをカラムにロードします。ライセートを重力流でカラムに流し、流れを回収します。収集されたフローが通過する状態でカラムをロードし、カラムに通します。</li>
	<li>少なくとも 2 つのレジンベッド容量の MS500 洗浄バッファー(20 mM の Tris pH 7.5、500 mM の NaCl、0.5 mM の TCEP)でカラムを 5 回洗浄します。洗浄フローを5 mLのフラクションで収集します。各画分1 μLを100 μLのBradford試薬に加えて、タンパク質の存在を視覚的に確認します。結合していないタンパク質が最後の洗浄で存在しなくなるまで洗浄し、必要に応じて追加の洗浄ステップを追加します。</li>
	<li>MS500溶出バッファー(MS500バッファーに10 mMのグルタチオンと10 mMのNaOHを添加)をカラムに通し、5 mLの溶出画分を回収してタンパク質を回収します。100 μLのBradford試薬に1 μLの溶出液を添加して、タンパク質の存在を確認します。Bradford試薬がタンパク質の存在を示さなくなったら、フラクションの収集を停止します。</li>
	<li>沈殿および遠心分離により緩衝液交換を行います。溶出液に2容量の4 M硫酸アンモニウムを添加し、曇るまで穏やかに反転させた後、4°Cで30分間、≥20,000 x g で遠心分離し、さらに5分間遠心分離してタンパク質を沈殿させます。各遠心分離後は、タンパク質ペレットを乱さずに上清を除去してください。</li>
	<li>タンパク質を25%グリセロールを添加したMS500に再溶解して保存します。タンパク質ペレットまたはタンパク質を-80°Cで保存バッファーに保存します。</li>
</ol>
4. in vitro ユビキチン鎖切断アッセイ
注:ユビキチン鎖の長さと結合タイプは、以前のレポート31 に記載されている、または経験的に決定されたDUB特異性に基づいて選択してください。必要であれば、このプロトコルを使用して、定義された長さおよび連鎖型の市販のユビキチン鎖のパネル上で、目的の野生型DUBの活性を試験することができる。375〜750ngのジ−ユビキチン鎖量および1〜2μMのDUB濃度は、アッセイ27の開始点として使用することができる。
<ol>
	<li>10x DUB活性化バッファー(500 mMのTris-HCl pH 7.5、500 mMのNaCl、100 mMのTCEP)を調製します。</li>
	<li>各DUBの各時点について、1x DUB活性化バッファー(DUBミックス)に合計2μMの精製GST-USP27Xを10μL調製します。マスターミックスを準備し、それらを時点に分割します。</li>
	<li>DUBミックスをRTで10分間インキュベートします。</li>
	<li>ユビキチン鎖を添加する前に、7 μLのSDS-PAGEローディングバッファーを時間0に添加して、脱ユビキチン化反応の開始を防ぎます。</li>
	<li>各DUBの各時点に、10 μL 1x DUB活性化バッファーで希釈した375 ngのK-63ジユビキチン鎖を添加します。総容量は反応あたり20μLです。</li>
	<li>チューブを30°Cでインキュベートし、7 μLのSDS-PAGEローディングバッファーで各点を停止します。</li>
	<li>4%-12%グラジエントゲルとユビキチンおよびUSP27Xのイムノブロット7,32を用いてSDS-PAGEを実施し、選択した時点におけるモノユビキチンの存在の変化を解析します。</li>
</ol>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67367/67367fig01v2.jpg"> 
図1:研究デザインの概略図(A)組換えタンパク質発現プラスミドによるコンピテント大腸菌細胞の形質転換。(B)組換えデユビキチル化酵素タンパク質の一晩の細菌発現。(C)重力流アフィニティーカラムを用いた組換えデユビキチル化酵素のタンパク質精製。(D)脱ユビキチン化活性を評価するためのin vitroユビキチン鎖切断アッセイ。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67367/67367fig01largev2.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

<meta charset="utf8"></head><body>切断アッセイを使用した神経発達障害におけるDUBバリアントの評価

<ol><li>Morris-Rosendahl, D. J., Crocq, M. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodevelopmental+disorders%3A+the+history+and+future+of+a+diagnostic+concept%5BTitle%5D)+AND+%22Dialogues+Clin+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neurodevelopmental disorders: the history and future of a diagnostic concept.</a> Dialogues Clin Neurosci. 22 (1), 65-72 (2020).</li>
<li>Ebstein, F., Küry, S., Papendorf, J. J., Krüger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodevelopmental+disorders+%28NDD%29+caused+by+genomic+alterations+of+the+ubiquitin-proteasome+system+%28UPS%29%3A+the+possible+contribution+of+immune+dysregulation+to+disease+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neurodevelopmental disorders (NDD) caused by genomic alterations of the ubiquitin-proteasome system (UPS): the possible contribution of immune dysregulation to disease pathogenesis.</a> Front Mol Neurosci. 14, 733012(2021).</li>
<li>Hershko, A., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin+system%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin system.</a> Annu Rev Biochem. 67 (10), 425-479 (1998).</li>
<li>Pickart, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+underlying+ubiquitination%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Mechanisms underlying ubiquitination.</a> Annu Rev Biochem. 70 (1), 503-533 (2001).</li>
<li>Komander, D., Clague, M. J., Urbé, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+the+chains%3A+structure+and+function+of+the+deubiquitinases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Breaking the chains: structure and function of the deubiquitinases.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (8), 550-563 (2009).</li>
<li>Yau, R., Rape, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+increasing+complexity+of+the+ubiquitin+code%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The increasing complexity of the ubiquitin code.</a> Nat Cell Biol. 18 (6), 579-586 (2016).</li>
<li>Koch, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((USP27X+variants+underlying+X-linked+intellectual+disability+disrupt+protein+function+via+distinct+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci+Alliance%22%5BJournal%5D)">USP27X variants underlying X-linked intellectual disability disrupt protein function via distinct mechanisms.</a> Life Sci Alliance. 7 (3), e202302258(2024).</li>
<li>Hao, Y. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((USP7+acts+as+a+molecular+rheostat+to+promote+WASH-dependent+endosomal+protein+recycling+and+is+mutated+in+a+human+neurodevelopmental+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">USP7 acts as a molecular rheostat to promote WASH-dependent endosomal protein recycling and is mutated in a human neurodevelopmental disorder.</a> Mol Cell. 59 (6), 956-969 (2015).</li>
<li>Fountain, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenic+variants+in+USP7+cause+a+neurodevelopmental+disorder+with+speech+delays%2C+altered+behavior%2C+and+neurologic+anomalies%5BTitle%5D)+AND+%22Genet+Med%22%5BJournal%5D)">Pathogenic variants in USP7 cause a neurodevelopmental disorder with speech delays, altered behavior, and neurologic anomalies.</a> Genet Med. 21 (8), 1797-1807 (2019).</li>
<li>Santiago-Sim, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biallelic+variants+in+OTUD6B+cause+an+intellectual+disability+syndrome+associated+with+seizures+and+dysmorphic+features%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Biallelic variants in OTUD6B cause an intellectual disability syndrome associated with seizures and dysmorphic features.</a> Am J Hum Genet. 100 (4), 676-688 (2017).</li>
<li>Beck, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linkage-specific+deubiquitylation+by+OTUD5+defines+an+embryonic+pathway+intolerant+to+genomic+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Linkage-specific deubiquitylation by OTUD5 defines an embryonic pathway intolerant to genomic variation.</a> Sci Adv. 7 (4), eabe2116(2021).</li>
<li>Cho, J., Park, J., Kim, E. E., Song, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+systems+for+profiling+deubiquitinating+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Assay systems for profiling deubiquitinating activity.</a> Int J Mol Sci. 21 (16), 1-16 (2020).</li>
<li>Matsui, S., Sandberg, A. A., Negoro, S., Seon, B. K., Goldstein, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isopeptidase%3A+A+novel+eukaryotic+enzyme+that+cleaves+isopeptide+bonds%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Isopeptidase: A novel eukaryotic enzyme that cleaves isopeptide bonds.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 79 (5), 1535-1539 (1982).</li>
<li>Rose, I. A., Warms, J. V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enzyme+with+ubiquitin+carboxy-terminal+esterase+activity+from+reticulocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">An enzyme with ubiquitin carboxy-terminal esterase activity from reticulocytes.</a> Biochemistry. 22 (18), 4234-4237 (1983).</li>
<li>Wilkinson, K. D., Cox, M. J., Mayer, A. N., Frey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+characterization+of+ubiquitin+ethyl+ester%2C+a+new+substrate+for+ubiquitin+carboxyl-terminal+hydrolase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Synthesis and characterization of ubiquitin ethyl ester, a new substrate for ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase.</a> Biochemistry. 25 (21), 6644-6649 (1986).</li>
<li>Pickart, C. M., Rose, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin+carboxyl-terminal+hydrolase+acts+on+ubiquitin+carboxyl-terminal+amides%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase acts on ubiquitin carboxyl-terminal amides.</a> J Biol Chem. 260 (13), 7903-7910 (1985).</li>
<li>Hadari, T., Warms, J. V. B., Rose, I. A., Hershko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ubiquitin+C-terminal+isopeptidase+that+acts+on+polyubiquitin+chains%3A+Role+in+protein+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A ubiquitin C-terminal isopeptidase that acts on polyubiquitin chains: Role in protein degradation.</a> J Biol Chem. 267 (2), 719-727 (1992).</li>
<li>Woo, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+ubiquitin+C-terminal+hydrolases+from+chick+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Multiple ubiquitin C-terminal hydrolases from chick skeletal muscle.</a> J Biol Chem. 270 (32), 18766-18773 (1995).</li>
<li>Woo, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+a+new+ubiquitin+C-terminal+hydrolase+%28UCH-1%29+with+isopeptidase+activity+from+chick+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of a new ubiquitin C-terminal hydrolase (UCH-1) with isopeptidase activity from chick skeletal muscle.</a> J Biochem. 121 (4), 684-689 (1997).</li>
<li>Baek, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+of+a+novel+ubiquitin-specific+protease%2C+UBP41%2C+with+isopeptidase+activity+in+chick+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning of a novel ubiquitin-specific protease, UBP41, with isopeptidase activity in chick skeletal muscle.</a> J Biol Chem. 272 (41), 25560-25565 (1997).</li>
<li>Wilkinson, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+of+the+polyubiquitin+degradation+signal%3A+Structure%2C+mechanism%2C+and+role+of+isopeptidase+T%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Metabolism of the polyubiquitin degradation signal: Structure, mechanism, and role of isopeptidase T.</a> Biochemistry. 34 (44), 14535-14546 (1995).</li>
<li>Hu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+a+UBP-family+deubiquitinating+enzyme+in+isolation+and+in+complex+with+ubiquitin+aldehyde%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of a UBP-family deubiquitinating enzyme in isolation and in complex with ubiquitin aldehyde.</a> Cell. 111 (7), 1041-1054 (2002).</li>
<li>Hu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+mechanisms+of+the+proteasome-associated+deubiquitinating+enzyme+USP14%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Structure and mechanisms of the proteasome-associated deubiquitinating enzyme USP14.</a> EMBO J. 24 (21), 3747-3756 (2005).</li>
<li>Gorka, M., Magnussen, H. M., Kulathu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+biology+tools+to+study+deubiquitinases+and+UBL+proteases%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemical biology tools to study deubiquitinases and UBL proteases.</a> Semin Cell Dev Biol. 132, 86-96 (2022).</li>
<li>Faesen, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+differential+modulation+of+USP+activity+by+internal+regulatory+domains%2C+interactors%2C+and+eight+ubiquitin+chain+types%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">The differential modulation of USP activity by internal regulatory domains, interactors, and eight ubiquitin chain types.</a> Chem Biol. 18 (12), 1550-1561 (2011).</li>
<li>Mevissen, T. E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OTU+deubiquitinases+reveal+mechanisms+of+linkage+specificity+and+enable+ubiquitin+chain+restriction+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">OTU deubiquitinases reveal mechanisms of linkage specificity and enable ubiquitin chain restriction analysis.</a> Cell. 154 (1), 169-184 (2013).</li>
<li>Kwasna, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+and+characterization+of+ZUFSP%2FZUP1%2C+a+distinct+deubiquitinase+class+important+for+genome+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Discovery and characterization of ZUFSP/ZUP1, a distinct deubiquitinase class important for genome stability.</a> Mol Cell. 70 (1), 150-164.e6 (2018).</li>
<li>Hu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-exome+sequencing+of+405+unresolved+families+identifies+seven+novel+intellectual+disability+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">X-exome sequencing of 405 unresolved families identifies seven novel intellectual disability genes.</a> Mol Psychiatry. 21 (1), 133-148 (2016).</li>
<li>Hartmann, I. Shaker Orbit - Revolving in Space Around the Samples? Eppendorf Lab Academy. Eppendorf Lab Academy. , at 
 <a target="_blank" href="https://www.eppendorf.com/us-en/lab-academy/lab-solutions/others/shaker-orbit-revolving-in-space-around-the-samples">https://www.eppendorf.com/us-en/lab-academy/lab-solutions/others/shaker-orbit-revolving-in-space-around-the-samples</a> (2020).</li>
<li>Smith, D. B., Johnson, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-step+purification+of+polypeptides+expressed+in+Escherichia+coli+as+fusions+with+glutathione+S-transferase%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Single-step purification of polypeptides expressed in Escherichia coli as fusions with glutathione S-transferase.</a> Gene. 67 (1), 31-40 (1988).</li>
<li>Ritorto, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+of+DUB+activity+and+specificity+by+MALDI-TOF+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Screening of DUB activity and specificity by MALDI-TOF mass spectrometry.</a> Nat Commun. 5, 4763(2014).</li>
<li>Bustos, F., Bustos, F. Immunoblotting using precast gels. , protocols.io (2024).</li>
<li>Wingfield, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+the+purification+of+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Overview of the purification of recombinant proteins.</a> Curr Protoc Protein Sci. 80, 6.1.1-6.1.35 (2015).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Amersham Protran 0.45 NC 200 mm &times; 200 mm 25/PK</td><td>Cytiva</td><td>10600041</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium sulfate</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC205872500</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1760 25</td><td></td></tr><tr><td>Anti- Ubiquitin (Mouse monoclonal)</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 646302, RRID:AB_1659269</td><td>(WB: 1:1000</td></tr><tr><td>)Anti-GST (Sheep polyclonal)</td><td>MRC-PPU 試薬およびサービス</td><td>Cat# S902A サードブリード</td><td>(WB: 1:1000)</td></tr> <tr><td>https://mrcppureagents.dundee.ac.uk/ バッフル培養フラスコ 2 L</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>10-042-5N</td><td></td></tr><tr><td>ブラッドフォード試薬</td><td>ミリポアシグマ</td><td>B6916-500ML</td><td></td></tr><tr><td>クロラムフェニコール</td><td>ゴールドバイオテクノロジー</td><td>C-105-25</td><td></td></tr><tr><td>コンプリート、プロテアーゼ阻害剤錠剤</td><td>ミリポアシグマ</td><td></td><td></td>5056489001</tr><tr><td>エコノコラム 1.5 &times; 5 cm</td><td>Bio-Rad</td><td>7371507</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf ThermoMixer F1.5&nbsp;</td><td>エッペンドルフ</td><td>5384000020</td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>マイクロソフト</td><td></td><td></td></tr><tr><td>https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel グリセロール</td><td>ジェネシー サイエンティフィック</td><td>18-205</td><td></td></tr><tr><td>イラストレーター</td><td>Adobe</td><td></td><td>https://www.adobe.com/products/illustrator.html</td></tr><tr><td>Image Studio</td><td>LI-COR バイオサイエンス</td><td></td><td>https://www.licor.com/bio/image-studio/</td></tr><tr><td>Inkscape</td><td>Inkscape</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>https://inkscape.org/ Invitrogen 4-12% NuPAGE 1mm 12 well gel</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0322BOX</td><td></td></tr><tr><td>IPTG (Isopropyl-b-D-Thiogalactopyranoside)</td><td>Genesee Scientific</td><td>20-109</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800CW Donkey anti-Goat IgG Secondary Antibody</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>Cat# 926-32214</td><td>(WB: 1:10000)</td></tr><tr><td>IRDye 800CW ロバ抗マウス IgG 二次抗体</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>Cat# 926-32212</td><td>(WB: 1:10000)</td></tr><tr><td>Isotemp デジタル ドライバス</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>サイエンティフィック サイエンティフィック カ88860022</td><td></td></tr><tr><td>K63 ジユビキチン</td><td>サウス ベイ バイオ LLC</td><td>SBB-UP0072</td><td></td></tr><tr><td>LB 寒天</td><td>ジェネシー サイエンティフィック</td><td>11-119</td><td></td></tr><tr><td>LB ブロス</td><td>ジェネシー サイエンティフィック</td><td>11-118</td><td></td></tr><tr><td>リゾチーム</td><td>金バイオテクノロジー</td><td>L-040-100</td><td></td></tr><tr><td>MaxQ 4000 卓上軌道シェーカー</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>SHKE4000-7</td><td></td></tr><tr><td>MES-SDS ランニングバッファー</td><td>ボストンバイオプロダクツインク</td><td>BP-177</td><td></td></tr><tr><td>ミニチューブローテーター</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>88-861-051</td><td></td></tr><tr><td>NuPage LDS サンプルバッファー 4x</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>オデッセイ&nbsp;FC Imager</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>43214</td><td></td></tr><tr><td>PageRuler Plus Ladder</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26620</td><td></td></tr><tr><td>pGEX6P1 ヒト USP27X</td><td>MRC-PPU 試薬およびサービス</td><td>DU21193</td><td>https://mrcppureagents.dundee.ac.uk/</td></tr> <tr><td>pGEX6P1 ヒト USP27X F313V</td><td>Addgene</td><td>225715</td><td>Koch et at 2024 (PMID: 38182161)</td></tr><tr><td>pGEX6P1 ヒト USP27X S404N</td><td>Addgene</td><td>225717</td><td>Koch et at 2024 (PMID: 38182161)</td></tr><tr><td>pGEX6P1 human USP27X Y381H</td><td>Addgene</td><td>225716</td><td>Koch et at 2024 (PMID: 38182161)</td></tr><tr><td>Pierce Glutathione Agarose</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16100</td><td></td></tr><tr><td>PMSF (Phenylmethylsulfonyl fluoride)</td><td>Gold Biotechnology</td><td>P-470-10</td><td></td></tr><tr><td>Polysorbate 20 (Tween 20)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC233360010</td><td></td></tr><tr><td>Rosetta 2 コンピテントセル</td><td>ミリポア Sigma</td><td>71402-M</td><td></td></tr><tr><td>SimplyBlue SafeStain</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>LC6060</td><td></td></tr><tr><td>SmartSpec 3000</td><td>バイオ・ラッド</td><td>170-2501</td><td></td></tr><tr><td>SOC メディウム</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>15544034</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td> ジェ<td>ネシーサイエンティフィック</td><td>18-216</td><td></td></tr><tr><td>ソニファイア 250</td><td>ブランソン</td><td>100-132-135</td><td></td></tr><tr><td>ソルバル RC 6 プラス 遠心分離機</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>46910</td><td></td></tr><tr><td>TCEP (トリス - (カルボキシエチル) ホスフィン塩酸塩)</td> <td>ゴールド バイオテクノロジー</td><td>TCEP10</td><td></td></tr><tr><td>テリフィック ブロス パウダー</td><td>ジェネシー サイエンティフィック</td><td>18-225</td><td></td></tr><tr><td>トリス ベース</td><td>ジェネシー サイエンティフィック</td><td>18-146</td><td></td></tr><tr><td>XCell SureLock ミニセルおよびXCell II ブロットモジュール&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>EI0002</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitroユビキチン鎖切断アッセイによる神経発達障害関連脱ユビキチン化酵素の酵素活性の測定

Measuring Enzymatic Activity of Neurodevelopmental Disorder-Associated Deubiquitylating Enzymes via an In Vitro Ubiquitin Chain Cleavage Assay

XLID105随変異体がUSP27X触媒活性に及ぼす影響を調べるため、GSTタグ付き野生型USP27XとXLID105随伴変異体F313V、Y381H、およびS404N USP27Xタンパク質を細菌から精製しました。これらの変異体は、USP27XのUSP触媒ドメイン内に位置しています(図2A)。USP27Xは以前にK63ユビキチン鎖を切断することが報告されていたため31、野生型USP27XおよびXLID105関連変異体であるF313V、Y381H、およびS404N USP27Xタンパク質をK63結合ジユビキチン鎖と1時間インキュベートした。これらのサンプルをSDS-PAGE32で分離し、ユビキチンタンパク質とUSP27Xタンパク質をイムノブロッティングで分析しました。野生型USP27Xは、ジユビキチン切断を誘導し、モノユビキチンを生成します(図2Bおよび補足図1)。XLID105関連F313V、Y381H、およびS404N USP27X変異体タンパク質は、これらの鎖を切断しませんでした。F313V、Y381H、およびS404Nの変異体はUSP27Xの触媒活性を阻害するため、USP27Xの機能破壊がXLID1057の根底にある主要なメカニズムであると考えられる。追加の定量化および補完的な実験は以前に報告されています7。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67367/67367fig02v2.jpg"> 
図2:XLID105変異体がUSP27Xの脱ユビキチン化活性に及ぼす影響(A)ヒトUSP27Xタンパク質構造の図で、USPドメイン(紫色)で評価されたXLID105変異体の残基数と位置を示す図。(B)GSTタグ付き野生型USP27XおよびXLID105変異体(F313V、Y381H、およびS404N)を、K63ジユビキチン鎖と示された時間インキュベートした。イムノブロット分析は、抗GST(USP27X)およびユビキチン抗体を用いて行いました。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67367/67367fig02largev2.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
補足図1:図2Bのトリミングされていないブロット。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67367/R1%20Koch%202024%20Jove%20supplemental%20Figure.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

In vitroユビキチン鎖切断アッセイによる神経発達障害関連脱ユビキチン化酵素の酵素活性の測定

Neurodevelopmental disorders (NDDs) are associated with impairments in nervous system function but often remain poorly understood at the molecular level. ...

measuring-enzymatic-activity-neurodevelopmental-disorder-associated

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

ユビキチン化は、3つの酵素のセットによって行わキー翻訳後修飾である。この変更に関与する遺伝子の変異が様々なヒト疾患に関連付けられています。ここで、我々は培養細胞でのタンパク質のユビキチン化を検出するためのプロトコルを説明...

タンパク質のユビキチン化の検出

現在のプロトコルは、機能的に相同脱ユビキチン化酵素の活性を測定する方法を詳述します。特殊なプローブは、共有結合酵素を変更し、検出を可能にします。この方法は、新たな治療標的を同定する可能性を保持しています。...

細胞株および組織試料中の脱ユビキチン化酵素の活性を測定する方法

ユビキチン化は、細胞プロセスで重要な役割を果たし、デュビキチン化によって緊密に調整される翻訳後修飾です。両方の反応の欠陥は、人間の病理の下にある。精製成分を用いてインビトロでユビキチン化・デュビキチン化反応を行うためのプロトコルを提供します。...

ヌクレオソームヒストンのインビトロユビキチン化とデュービキチン化アッセイ

このプロトコルは、げっ歯類の脳の異なる細胞区画におけるユビキチンプロテアソーム系(UPS)活性を効率的に定量するように設計されている。ユーザーは、同じ動物の核、細胞質およびシナプス画のUPS機能を調べることができ、これらの複雑な分析を行うために必要な時間と動物の数を減らすことができます。...

げっ歯類脳における細胞内ユビキチンプロテアソーム活性の定量化

この方法はユビキチン鎖トポロジーにおけるグローバルな変化の評価を記述する。この評価は、質量分析法に基づく標的プロテオミクスアプローチの適用によって行われます。...

並列反応モニタリングによるユビキチン連鎖解析

本研究は、E3ユビキチンリガーゼ触媒活性の分析のための詳細な インビトロ ユビキトリメンテーションアッセイプロトコルを提供する。組換えタンパク質は 、大腸菌...

イン・ヴィトロ E3ユビキチンリガーゼ関数の解析

機能の喪失と獲得がアンジェルマン症候群と自閉症スペクトラム障害の両方に関連している...

Ube3a変異体の機能評価のためのスケーラブルな細胞ベースの方法

ここで使用した実験は、分子ドッキングとプローブ技術を組み合わせて、伝統的な漢方薬の低分子とタンパク質標的との間の相互作用を予測および検証する方法を示しています。...

分子ドッキングおよび脱ユビキチン化酵素プローブ技術に基づくUCHL3活性阻害のための漢方薬化合物のスクリーニング

酵素スクリーニングのためのハイスループットアッセイについて説明しています。このマルチプレックスのすぐに使用できるアッセイキットは、事前に選択されたC高原性PオリマーHイドロゲル(CPH)基質と複合体I不溶性C糖素性Bアイオマス(ICB)基質で構成されています。標的酵素は、多糖類分解エンド酵素とプロテアーゼです。...

新規不溶性発色基質アッセイキットを使用した炭水化物分解酵素のハイスループットスクリーニング

サイクリン依存性キナーゼ 1 (Cdk1) 細胞周期 G2 段階で活性化し、多くの細胞経路を調節します。この重要なキナーゼの細胞内標的を確立するため Cdk1 固有のリン酸化部位の同定を可能にする Cdk1...

サイクリン依存性キナーゼ 1 の同定の in Vitroキナーゼによって特定のリン酸化のサイトの試金します。

学ぶ神経発達障害関連の脱ユビキチン化酵素活性測定法。in vitroユビキチン鎖切断アッセイを用いて、遺伝子変異が酵素活性に与える影響を直接測定し、病態メカニズムの解明に貢献します。

In vitroユビキチン鎖切断アッセイによる神経発達障害関連脱ユビキチン化酵素の酵素活性の測定

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