一過性限局性虚血と組み合わせた急性高血糖によって誘発される出血性形質転換のマウスモデル

現在の研究では、急性高血糖の C57BL/6 マウスにおける中大脳動脈閉塞再灌流を使用したヒトラジカル形質転換の再現性の高い動物モデルを確立するための包括的で詳細なプロトコルを提供することを目指しています。

他の技術と比較して、当社のプロトコルは優れた再現性、高い安定性、および低い動物死亡率を示しており、出血性形質転換の前臨床研究での広範な使用に適しています。

将来的には、出血性形質転換が神経学に及ぼす影響を調査し、その根底にあるメカニズムを調査することに重点を置きます。

[講師]まず、手術台と周囲の作業エリアを 75% エタノールで拭きます。加熱スイッチをオンにし、温度を摂氏37度に設定します。麻酔をかけたマウスを仰臥位で手術台に移動し、粘着テープを使用して手足を固定します。次に、外科的処置の15分前に、マウスに30%のグルコースまたは生理食塩水を腹腔内に投与します。メスを使用して、首の正中線に沿って1.5センチメートルの開口部で水平に切開します。逆三角形領域内で鈍的解剖を行い、左総頸動脈を特定して分離します。眼科鉗子を使用して、総頸動脈に隣接する迷走神経と血管を取り巻く粘膜組織を解剖します。5-0ポリグリコール酸吸収性縫合糸を使用して、総頸動脈にリンガーを作り、縫合糸に張力をかけたままにします。次に、総頸動脈に沿って上向きに分離します。次に、分岐部を分離して、外頸動脈と内頸動脈を完全に露出させます。5-0 ポリグリコール酸吸収性縫合糸を、分岐部から遠位の外頸動脈の周りにループし、しっかりと結びます。次に、2 つの軽いマイクロ セラフィン動脈クランプを使用して、総頸動脈と内頸動脈の両方を一時的にクランプして血流を遮断します。次に、遠位外頸動脈と総頸動脈の縫合糸を伸ばして、外頸動脈セグメントをまっすぐにします。次に、マイクロハサミを使用して、外頸動脈の2つの縫合糸の間に小さな切開を行います。長さ 30 mm のシリコンでコーティングされたモノフィラメント縫合糸を外頸動脈に挿入します。モノフィラメント縫合糸が後退するのを防ぐために、分岐部近くの外頸動脈に2番目の5-0ポリグリコール酸吸収性縫合糸をループしてわずかに結びます。次に、永久結紮の遠位にある外頸動脈を完全に切断し、動脈鉗子クランプを内頸動脈から取り外します。次に、総頸動脈の分岐点まで縫合糸を引き抜きます。外頸動脈断端を慎重に引っ込めて回転させます。縫合方向を調整し、総頸動脈分岐部から内頸動脈に9〜10ミリメートル挿入して、中大脳動脈を塞ぎます。次に、外頸動脈の周りの2番目のポリグリコール酸吸収性縫合糸を締め、総頸動脈から動脈クランプを取り外します。マウスを再麻酔した後、マイクロクリップ動脈クランプを使用して、総頸動脈をクランプします。シリコンでコーティングされた先端が内頸動脈を通して見えるようになるまで、内頸動脈からモノフィラメントを部分的に引っ込めます。次に、シリコンでコーティングされた先端の上の内頸動脈に別のマイクロクリップ動脈クランプを配置します。モノフィラメントを完全に引き抜き、外頸動脈断端をしっかりと固定します。最後に、内頸動脈と総頸動脈からそれぞれマイクロクリップ動脈クランプを取り外します。まず、アルコールを染み込ませた綿球でマウスの尻尾を拭き、尾静脈を完全に充血させます。手術用はさみを使用して、尾の先端を1〜2ミリ切り落とします。尾の付け根に沿って先端までそっと絞って、切開部からの血流を促進します。次に、試験紙のサンプル吸収タンクを血滴の端に配置します。血糖測定器の読み取り値を読み取り、結果を記録します。脳血流測定の場合は、安定したフラックスが読み取られるまで、レーザードップラー流量測定プローブの先端を左頭頂頭蓋骨の表面に対して垂直に保持し、この値を記録します。安楽死させたMCAOマウスの脳を摘出した後、脳組織をげっ歯類の脳マトリックスに入れ、2ミリメートルの冠状スライスに切断します。スライスを24ウェルプレートに移し、2%2,3,5-トリフェニルテトラゾリウム塩化物溶液と摂氏37度で15分間インキュベートします。 その後、湾曲した鉗子で24ウェルプレートから組織切片をクリップで切り出し、ガラススキャンプレート上に配置します。固定された脳スライスをヘマトキシリン溶液で3分間染色します。スライスを5%塩酸アルコールに5秒間浸して区別します。次に、グラジエントエタノール溶液とキシレンを使用してスライスを脱水し、ヒアリン化します。中性樹脂でセクションを取り付けます。MCAOの23時間後、2%エバンスブルー溶液をマウスに注入し、脳を採取します。組織を均質化して遠心分離した後、上清液を別の遠心分離管に移し、エタノールで4倍に希釈します。分光光度計を用いて620ナノメートルの上清液の吸光度を測定する。MCAOの24時間後にFITC-デキストランを尾静脈に注射し、10分間血中を循環させます。脳組織を固定した後、最適な切断温度コンパウンドを使用して脳組織を埋め込み、厚さ30マイクロメートルの切片に切断します。接種ループを使用して切片を顕微鏡スライドに移し、スライドの表面に確実に付着します。4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドールを含む封入培地を使用して脳組織切片をマウントします。血糖値は、生理食塩水群と比較して、グルコースを注射したマウスのMCAO後に有意に増加しました。生理食塩水を使用した偽またはグルコースを使用した偽の脳スライスに目に見える梗塞は観察されませんでした。グルコースを含むMCAOグループは、生理食塩水を含むMCAOグループと比較して有意に大きな脳梗塞量を示しました。マルチ点状出血は、グルコース群のMCAOの虚血半球で観察されましたが、他のグループには存在しませんでした。ブルコース群の MCAO の皮質および線条体の梗塞領域に有意な血球浸潤が認められました。エバンスブルー透過性とFITC-デキストラン漏出は、生理食塩水を使用したMCAOグループと比較して、グルコースを含むMCAOグループで著しく高かった。