Name: アデノ随伴ウイルス血清型8(AAV8)送達低分子ヘアピンRNAの脾腔内注射による肝臓における効率的な遺伝子ノックダウン (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-01T14:50:00.000+00:00
Duration: 4 min 29 s
Description: 学ぶAAV8を用いた脾腔内注射による肝臓での遺伝子ノックダウン法。ポータル静脈注射と同等の効率で、合併症が少なくより簡便な手技を確立。遺伝子治療研究に有用です。

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<meta charset="utf8"></head><body>効率的で安全な肝臓遺伝子ノックダウンのための脾腔内AAV8-shRNA注入

<ol><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenome-wide+analysis+of+aging+effects+on+liver+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Epigenome-wide analysis of aging effects on liver regeneration.</a> BMC Biol. 21 (1), 30(2023).</li>
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<li>Lin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleostemin+reveals+a+dichotomous+nature+of+genome+maintenance+in+mammary+tumor+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Nucleostemin reveals a dichotomous nature of genome maintenance in mammary tumor progression.</a> Oncogene. 38 (20), 3919-3931 (2019).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleostemin+modulates+outcomes+of+hepatocellular+carcinoma+via+a+tumor+adaptive+mechanism+to+genomic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Nucleostemin modulates outcomes of hepatocellular carcinoma via a tumor adaptive mechanism to genomic stress.</a> Mol Cancer Res. 18 (5), 723-734 (2020).</li>
<li>Crawford, M., Liu, X., Cheng, Y. L., Tsai, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleostemin+upregulation+and+stat3+activation+as+early+events+in+oral+epithelial+dysplasia+progression+to+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Nucleostemin upregulation and stat3 activation as early events in oral epithelial dysplasia progression to squamous cell carcinoma.</a> Neoplasia. 23 (12), 1289-1299 (2021).</li>
<li>Lin, T., Meng, L., Wu, L. J., Pederson, T., Tsai, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleostemin+and+gnl3l+exercise+distinct+functions+in+genome+protection+and+ribosome+synthesis%2C+respectively%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Nucleostemin and gnl3l exercise distinct functions in genome protection and ribosome synthesis, respectively.</a> J Cell Sci. 127 (10), 2302-2312 (2014).</li>
<li>Tsai, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balancing+self-renewal+against+genome+preservation+in+stem+cells%3A+How+do+they+manage+to+have+the+cake+and+eat+it+too%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Balancing self-renewal against genome preservation in stem cells: How do they manage to have the cake and eat it too.</a> Cell Mol Life Sci. 73 (9), 1803-1823 (2016).</li>
<li>Meng, L., Hsu, J. K., Tsai, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gnl3l+depletion+destabilizes+mdm2+and+induces+p53-dependent+G2%2Fm+arrest%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Gnl3l depletion destabilizes mdm2 and induces p53-dependent G2/m arrest.</a> Oncogene. 30 (14), 1716-1726 (2011).</li>
<li>Huang, G., Meng, L., Tsai, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P53+configures+the+G2%2Fm+arrest+response+of+nucleostemin-deficient+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Discov%22%5BJournal%5D)">P53 configures the G2/m arrest response of nucleostemin-deficient cells.</a> Cell Death Discov. 1, e15060(2015).</li>
<li>Liu, X., Wang, J., Wu, L. J., Trinh, B., Tsai, R. Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IMPDH+inhibition+decreases+TERT+expression+and+synergizes+the+cytotoxic+effect+of+chemotherapeutic+agents+in+glioblastoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">IMPDH inhibition decreases TERT expression and synergizes the cytotoxic effect of chemotherapeutic agents in glioblastoma cells.</a> Int J Mol Sci. 25 (11), 5992(2024).</li>
<li>Liu, X., Wang, J., Li, F., Timchenko, N., Tsai, R. Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+control+of+a+stem+cell+factor+nucleostemin+in+liver+regeneration+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Transcriptional control of a stem cell factor nucleostemin in liver regeneration and aging.</a> PLoS One. 19 (9), e0310219(2024).</li>
<li>Mayra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraperitoneal+AAV9-shRNA+inhibits+target+expression+in+neonatal+skeletal+and+cardiac+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Intraperitoneal AAV9-shRNA inhibits target expression in neonatal skeletal and cardiac muscles.</a> Biochem Biophys Res Commun. 405 (2), 204-209 (2011).</li>
<li>Cohen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-mediated+shRNA+knockdown+of+prodynorphin+in+the+rat+nucleus+accumbens+attenuates+depression-like+behavior+and+cocaine+locomotor+sensitization%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Virus-mediated shRNA knockdown of prodynorphin in the rat nucleus accumbens attenuates depression-like behavior and cocaine locomotor sensitization.</a> PLoS One. 9 (5), e97216(2014).</li>
<li>Jeon, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topbp1+deficiency+causes+early+embryonic+lethality+and+induces+cellular+senescence+in+primary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Topbp1 deficiency causes early embryonic lethality and induces cellular senescence in primary cells.</a> J Biol Chem. 286 (7), 5414-5422 (2011).</li>
<li>Smith, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-mediated+expression+of+therapeutic+plasma+levels+of+human+factor+IX+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-mediated expression of therapeutic plasma levels of human factor IX in mice.</a> Nat Genet. 5 (4), 397-402 (1993).</li>
<li>Nakai, H., Iwaki, Y., Kay, M. A., Couto, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+recombinant+adeno-associated+virus+vector-cellular+DNA+junctions+from+mouse+liver%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Isolation of recombinant adeno-associated virus vector-cellular DNA junctions from mouse liver.</a> J Virol. 73 (7), 5438-5447 (1999).</li>
<li>Jung, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+viral+vector-mediated+gene+transfer+results+in+long-term+enzymatic+and+functional+correction+in+multiple+organs+of+Fabry+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated viral vector-mediated gene transfer results in long-term enzymatic and functional correction in multiple organs of Fabry mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (5), 2676-2681 (2001).</li>
<li>Hurford, R. K., Dranoff, G., Mulligan, R. C., Tepper, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+of+metastatic+cancer+by+in+vivo+retroviral+gene+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Gene therapy of metastatic cancer by in vivo retroviral gene targeting.</a> Nat Genet. 10 (4), 430-435 (1995).</li>
<li>Sarkar, R., Xiao, W., Kazazian, H. H. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+adeno-associated+virus+%28AAV%29-murine+factor+viii+vector+partially+corrects+the+hemophilia+a+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">A single adeno-associated virus (AAV)-murine factor viii vector partially corrects the hemophilia a phenotype.</a> J Thromb Haemost. 1 (2), 220-226 (2003).</li>
<li>Czekaj, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+methods+for+intrasplenic+administration+of+human+amniotic+epithelial+cells+in+order+to+perform+safe+and+effective+cell-based+therapy+for+liver+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev+Rep%22%5BJournal%5D)">Optimization of methods for intrasplenic administration of human amniotic epithelial cells in order to perform safe and effective cell-based therapy for liver diseases.</a> Stem Cell Rev Rep. 20 (6), 1599-1617 (2024).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>アミコンフィルター遠心分離ユニット</td><td>MilliporeSigma</td><td>UFC9100</td><td>高速限外ろ過</td></tr><tr><td>AV5-siRNA-GFP&nbsp;</td><td>Addgene&nbsp;</td><td>#124972</td><td>プラスミド</td></tr><tr><td>コンピテントDH5&α;細菌&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>#18265-017</td>クロー<td>ニング用の化学的にコンピテントな株&nbsp;</td></tr><tr><td>HpaI&nbsp;</td><td>ニューイングランド バイオラボ</td><td>R0105</td><td>制限酵素</td></tr><tr><td>iMFectin トランスフェクション試薬&nbsp;</td><td>GenDepot</td><td>I7100-101</td><td></td></tr><tr><td>M-MLV 逆転写酵素&nbsp;</td><td>Promega</td><td>M1708</td><td>RNA依存性DNAポリメラーゼ&nbsp;</td></tr><tr><td>MyiQ単色リアルタイムPCR検出システム&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>BUN9740RAD</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>オメガエンドトキシンフリーキット&nbsp;</td><td>Bioteck</td><td>D6915-03</td>プラス<td>ミドDNAミディプレップ&nbsp;</td></tr><tr><td>ランダムヘキサマー&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>48190-011</td><td></td></tr><tr><td>スーパーミックス SYBR グリーン試薬&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1708882</td><td>リアルタイム PCR アプリケーション</td></tr><tr><td>T4 DNA リガーゼ</td><td>Promega</td><td>M1801</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol 試薬&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>15596-018</td><td>高品質のトータル RNA</td></tr><tr><td>XhoI</td> の単離 <td>New England Biolabs</td><td>R0146</td><td>制限酵素</td></tr></tbody></table>

アデノ随伴ウイルス血清型8(aav8)送達低分子ヘアピンrnaの脾腔内注射による肝臓における効率的な遺伝子ノックダウン

Efficient Gene Knockdown in the Liver via Intrasplenic Injection of Adeno-Associated Virus Serotype 8 (AAV8)-Delivered Small Hairpin RNA

脾臓内 と脾臓内による肝臓における遺伝子KDの効率AAV8-shRNAの門脈注入 AAV8ウイルスストックを、ミリリットル(gc/mL)あたり2E+12ゲノムコピー(gc)の使用濃度に希釈しました。個々のマウスに1E+11 gcのAAV8-shNS1またはAAV8-shScr(50 μL)を脾臓内または門脈注射 により 注射しました。注射の2週間後、RNA単離、1本鎖cDNA合成、およびqPCR分析のために肝臓組織を採取しました。その結果、脾腔内注射法は、 Rsp3 と Rplp0 を内部基準として用いた門脈注射法(16.3±3.6%)と統計的に同等のNSKD効率(20.8%±4.4%)を達成しました(図2)。さらに注目すべきは、脾腔内注射の施術は15分以内に完了し、施術による死亡がほとんどなかったのに対し、門脈注射法は通常、多くの練習で25〜30分かかり、死亡率が高い(死亡率~25%〜30%)と関連していたことです。
組織炎症反応 AAV8-shScr(図3A)またはAAV8-shNS1(図3B)の門脈注射または脾腔内注射を受けたマウスから肝臓組織を採取し、対照マウス(図3C)と比較しました。炎症反応はH&amp;E染色4によって調べた。その結果、AAV8-shScrもAAV8-shNS1も、脾腔内注射(Spl)または門脈注射(PV)法のいずれかで注入されたPBSと比較して、肝実質で顕著な炎症反応を引き起こさなかったことが示されました(図3A-C)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67376/67376fig01.jpg"> 
図1:AAV8-shRNAの設計と脾腔内注入手順の図(A)(上)in vivoノックダウン実験用のアデノ随伴ウイルス血清型8(AAV8)を作製するために設計されたAV5-siRNA-GFPプラスミドの図。AV5-siRNA-GFPには、CMVプロモーター駆動型shRNA配列とEGFPが含まれています。(ボトム)マウスNS(shNS1)またはスクランブルされた21ヌクレオチド配列(Scr)上の21ヌクレオチド配列を標的とするために設計された小さなヘアピンRNAiコンストラクト。(B)脾腔内AAV8注入手順の概略ワークフロー図。(C)外科的処置の段階的なビュー。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67376/67376fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67376/67376fig02.jpg"> 
図2:脾臓内注射と門脈注射による肝臓におけるAAV8-shRNAを介したヌクレオステミン(NS)のノックダウンの効率。 AAV8-shScrまたはAAV8-shNS1(1E + 11 gc)の脾臓内(Spl)または門脈(PV)注射を受けてから2週間後にマウスから採取した肝臓サンプルにおけるNS発現のqRT-PCRアッセイ。グラフは、Rps3 (A) と Rplp0 (B) の 2 つの内部コントロールを基準にした結果を示しています。バーは±それぞれが3回のPCRテクニカルリピートを持つ4つの生物学的複製の平均SEMを示しています。*p &lt; 0.01;**p &lt; 0.001;p &lt; 0.0001 です。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67376/67376fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67376/67376fig03.jpg"> 
図3:PBS、AAV8-shScr、またはAAV8-shNS1の脾腔内注射または門脈注射後の肝臓組織の組織学。 AAV8-shScr (A) または AAV8-shNS1 (B) の脾腔内注射 (Spl) または門脈注射 (PV) の 2 週間後における肝臓組織の H&amp;E 染色を、対照の非 AAV8 注射サンプルと比較 (C) と比較。スケールバー:100μm。右側のパネルは、左側のパネルのインセットを拡大して表示しています。スケールバー:50μm。2つの異なる動物からの6〜9つの切片が各グループで調べられました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67376/67376fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

アデノ随伴ウイルス血清型8(AAV8)送達低分子ヘアピンRNAの脾腔内注射による肝臓における効率的な遺伝子ノックダウン

The liver is a major organ that performs essential metabolic functions. Developing an efficient and safe method to knock down gene expression in the liver ...

efficient-gene-knockdown-liver-via-intrasplenic-injection-adeno

Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

この記事では、我々はヒト肝癌細胞を標的とするための最も効率的なベクターとしてアデノ随伴ウイルス3型（AAV3）の識別について説明します。...

組換えアデノ随伴ウイルスの血清型3つのベクトルによる肝癌細胞の高効率形質導入

我々は分子DNAファミリーシャフリングを介して合成アデノ随伴ウイルス（AAV）の遺伝子治療ベクターを設計し、進化するための基本的なテクニックを示しています。さらに、一般的なガイドラインや文化やマウスの標的細胞上の強化されたプロパティを持つ個々のキメラキャプシドの選択と分析のための代表的な例を提供しています。...

シャッフルDNAファミリーを経由して合成アデノ随伴ウイルス（AAV）遺伝子治療ベクターのエンジニアリングと進化

RNA干渉（RNAi）は遺伝子ノックアウトよりも多くの利点を有し、広範に遺伝子機能研究のツールと​​して使用されています。...

癌における遺伝子機能を研究するDNAベクターベースのRNA干渉

このビデオでは、shRNAレンチウイルスベクターの形質導入を行い、不死化造血幹細胞および前駆細胞(iHSPC)で安定したノックダウン細胞株を得る方法を示します。...

Short Hairpin RNA-Mediated Gene Knockdown in iHSPCs In Vitro:特定の遺伝子発現のノックダウンのためのレンチウイルスベースのshRNA発現システムのiHSPCへのデリバリー

このビデオでは、マウスの子犬における組換えアデノ随伴ウイルスベースの遺伝子導入を実演しています。この方法は、標的細胞における遺伝子発現の研究に役立ちます。...

組換えアデノ随伴ウイルスベースの遺伝子導入:げっ歯類モデルにおける導入遺伝子導入および心臓特異的発現のための技術

この論文では、マウスの心臓における遺伝子発現を操作するための組換えアデノ随伴ウイルス9（rAAV9）ベクターを調製する方法について記載しています。...

マウスハーツでの遺伝子を過剰発現またはノックダウンするrAAV9の調製

ここで我々 はマイクロ Rna 組換えアデノ随伴ウイルス血清型 9 を使用して神経筋疾患のマウスモデルでの配信をについて説明します。単一の末梢投与マウスにおける筋と運動ニューロン、miRNA の機能を検討し、治療の潜在的なin vivoする機会を提供することで持続的な miRNA...

マイクロ Rna の齧歯動物の神経筋疾患を治療する遺伝子組換えアデノ随伴ウイルス血清型 9 を使用しての全身配信

結腸直腸癌(CRC)オルガノイドの門脈注入は、間質に富む肝転移を生じる。CRC肝転移のこのマウスモデルは、腫瘍間質相互作用を研究し、アデノ随伴ウイルス媒介遺伝子治療などの新規間質指向性治療薬を開発するための有用なツールである。...

肝転移間質を研究するための結腸直腸癌オルガノイドの門脈注入

ここでは、成体マウスにアデノ随伴ウイルス(AAV)を全身投与するためのマウス側尾静脈注射の最適化されたプロトコルについて詳しく説明します。さらに、AAV形質導入を評価するために一般的に使用されるアッセイのプロトコルについても説明します。...

成体マウスにおける側方尾静脈注射によるアデノ随伴ウイルスの一貫した送達

このレポートでは、マウス腎臓への効果的かつ安全な遺伝子導入のための腎盂 を介した AAV...

アデノ随伴ウイルスベクターの低速逆行性腎盂注射 による マウス腎臓への効果的かつ安全な遺伝子送達

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アデノ随伴ウイルス血清型8(AAV8)送達低分子ヘアピンRNAの脾腔内注射による肝臓における効率的な遺伝子ノックダウン

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