Name: 新鮮凍結ヒト脳切片から放出される小さな細胞外小胞におけるマイクロRNAカーゴの力の利用 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-08T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: 学ぶ 新鮮凍結脳切片から高速遠心分離とサイズ排除クロマトグラフィーを用いて小さな細胞外小胞を抽出し、神経疾患のマイクロRNAバイオマーカーを同定する方法。この再現性の高いプロトコルは早期診断の向上に貢献します。

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<meta charset="utf8"></head><body>バイオマーカー探索のための最小限の組織からの脳sEVの効率的な単離

<ol><li>Jia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+extracellular+vesicles+isolation+and+separation%3A+Current+techniques%2C+pending+questions+and+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Small extracellular vesicles isolation and separation: Current techniques, pending questions and clinical applications.</a> Theranostics. 12 (15), 6548-6575 (2022).</li>
<li>Fornari, S., Schäfer, A., Jucker, M., Goriely, A., Kuhl, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion-like+spreading+of+Alzheimer%27s+disease+within+the+brain%27s+connectome%5BTitle%5D)+AND+%22J+R+Soc+Interface%22%5BJournal%5D)">Prion-like spreading of Alzheimer's disease within the brain's connectome.</a> J R Soc Interface. 16 (159), 20190356(2019).</li>
<li>Zhang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-derived+small+extracellular+vesicles+in+cancer+invasion+and+metastasis%3A+molecular+mechanisms%2C+and+clinical+significance%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumor-derived small extracellular vesicles in cancer invasion and metastasis: molecular mechanisms, and clinical significance.</a> Mol Cancer. 23 (1), 18(2024).</li>
<li>Constantinides, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CSF+A%CE%B242+and+A%CE%B242%2F+A%CE%B240+ratio+in+Alzheimer%27s+disease+and+frontotemporal+dementia%5BTitle%5D)+AND+%22Diagnostics%22%5BJournal%5D)">CSF Aβ42 and Aβ42/ Aβ40 ratio in Alzheimer's disease and frontotemporal dementia.</a> Diagnostics. 13 (4), 783(2023).</li>
<li>Cheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+serum+miRNA+biomarkers+associated+with+Alzheimer%27s+disease+shows+concordance+with+neuropsychological+and+neuroimaging+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Prognostic serum miRNA biomarkers associated with Alzheimer's disease shows concordance with neuropsychological and neuroimaging assessment.</a> Mol Psychiatry. 20 (10), 1188-1196 (2015).</li>
<li>Roser, A. E., Caldi Gomes, L., Schünemann, J., Maass, F., Lingor, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+miRNAs+as+diagnostic+biomarkers+for+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Circulating miRNAs as diagnostic biomarkers for Parkinson's disease.</a> Front Neurosci. 12, 625(2018).</li>
<li>Jackson, N., Guerrero-Muñoz, M. J., Castillo-Carranza, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prion-like+transmission+of+tau+oligomers+via+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Aging+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The prion-like transmission of tau oligomers via exosomes.</a> Front Aging Neurosci. 14, 974414(2022).</li>
<li>Vella, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rigorous+method+to+enrich+for+exosomes+from+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">A rigorous method to enrich for exosomes from brain tissue.</a> J Extracell Vesicles. 6 (1), 1348885(2017).</li>
<li>Yousif, G., Qadri, S., Parray, A., Akhthar, N., Shuaib, A., Haik, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+derived+neuronal+markers%3A+Immunoaffinity+isolation+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromolecular+Med%22%5BJournal%5D)">Exosomes derived neuronal markers: Immunoaffinity isolation and characterization.</a> Neuromolecular Med. 24 (3), 339-351 (2022).</li>
<li>Kumar, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+microfluidic+approaches+for+the+isolation+and+detection+of+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22TRAC-Trend+Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Recent advances in microfluidic approaches for the isolation and detection of exosomes.</a> TRAC-Trend Anal Chem. 159, 116912(2023).</li>
<li>Ransom, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+brain+small+extracellular+vesicles+contain+selectively+packaged%2C+full-length+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Human brain small extracellular vesicles contain selectively packaged, full-length mRNA.</a> Cell Rep. 43 (4), 114061(2024).</li>
<li>Gomes, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+isolation+method+for+spontaneously+released+extracellular+vesicles+from+brain+tissue+and+its+implication+for+stress-driven+brain+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Commun+Signal%22%5BJournal%5D)">A novel isolation method for spontaneously released extracellular vesicles from brain tissue and its implication for stress-driven brain pathology.</a> Cell Commun Signal. 21 (1), 35(2023).</li>
<li>Welsh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+%28MISEV+2023%29%3A+From+basic+to+advanced+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles (MISEV 2023): From basic to advanced approaches.</a> J Extracell Vesicles. 13 (2), e12404(2023).</li>
<li>Théry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+%28MISEV2018%29%3A+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).</li>
<li>Pirisinu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+long+journey+of+extracellular+vesicles+towards+global+scientific+acclamation%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Pharm+Bull%22%5BJournal%5D)">The long journey of extracellular vesicles towards global scientific acclamation.</a> Adv Pharm Bull. 13 (3), 489-501 (2023).</li>
<li>Bender, A., Sullivan, B. P., Lillis, L., Posner, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+and+chemical-based+methods+to+inactivate+endogenous+blood+ribonucleases+for+nucleic+acid+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">Enzymatic and chemical-based methods to inactivate endogenous blood ribonucleases for nucleic acid diagnostics.</a> J Mol Diagn. 22 (8), 1030-1040 (2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>メルク</td><td>A9418-100G</td><td></td></tr><tr><td>セルマスク オレンジ 原形質膜染色</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>C10045</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼIII型</td><td>StemCell Technologies</td><td>07422</td><td></td></tr><tr><td>ExoSpin Columns and Buffer</td><td>Cell Guidance Systems Ltd.</td><td>EX01-50</td><td>このキットには、この実験で使用したSECカラム、沈殿バッファ、EVフリーPBSが含まれています。</td></tr><tr><td>Halt Protease Inhibitor Cocktail (100x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>78429</td><td></td></tr><tr><td>Hibernate-E Medium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1247601</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli Sample Buffer (4x)</td><td>BioRad</td><td>1610747</td><td></td></tr><tr><td>Lexogen Small RNA-Seq Library Prep Kit</td><td>Lexogen</td><td>052.24</td><td>このキットには、i7 Index プライマープレート付きの Small RNA 調製試薬ボックスが含まれています。&nbsp;</td></tr><tr><td>miRNeasy Micro Kit (50)</td><td>Qiagen</td><td>217084</td><td>このキットには、高品質のRNA回収溶解試薬(Qiazol)、RNA分離カラム、分離バッファー(RWT、RPE)、RNaseフリーウォーターが含まれています。</td></tr><tr><td>MiSeq 試薬キット v3</td><td>Illumina</td><td>MS-102-3001</td><td>これは Illumina 調製キット</td></tr><tr><td>ニトロセルロース メンブレン、0.45 &mu;m</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>88018</td><td></td></tr><tr><td>PE/Dazzle 594 抗ヒト CD63 抗体</td><td>BioLegend</td><td>143914</td><td>fNTA分析に使用</td></tr><tr><td>PE/Dazzle 594 抗ヒト CD81 抗体</td><td>BioLegend</td><td>349520</td><td>fNTA分析に使用</td></tr><tr><td>PE/Dazzle 594 抗ヒト CD9 抗体</td><td>BioLegend</td><td>312118</td><td>fNTA分析に使用</td></tr><tr><td>PhosSTOP</td><td>メルク</td><td></td><td></td>4906845001</tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25530049</td><td></td></tr><tr><td>Qubit microRNA Assay Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q32880</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 1X dsDNA HS assay kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q33230</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 3.0 Fluorometer</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>RIPA Lysis and Extraction Buffer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>89901</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>34094</td><td></td></tr></tbody></table>

新鮮凍結ヒト脳切片から放出される小さな細胞外小胞におけるマイクロrnaカーゴの力の利用 

Harnessing the Power of MicroRNA Cargoes in Small Extracellular Vesicles Released from Fresh-Frozen Human Brain Sections

BDsEVの存在を確認するために、ウェスタンブロッティング、NTA、TEMの3つの手法を利用しました(図3)。ウェスタンブロットの結果(図3A および 補足ファイル1)は、5つの陽性マーカー(CD9、CD63、CD81、Flot-1、およびTSG101)すべての存在と、sEVにおけるカルネキシンの不在(ネガティブコントロールとして使用)を示しており、細胞内容物による汚染がないことを確認しています。予想通り、脳のホモジネート(BH)は、試験したマーカーのsEVで観察されたよりも多くのタンパク質を示しています。TEM画像は、BDsEVの形態とサンプル内のそれらの相対的なサイズを確認し(図3B)、これはナノ粒子追跡分析によってさらに確認されました(図3C)。
図3C (上パネル)は、50〜200nmの単離粒子サイズを示しています。国税庁のデータから、散乱結果を表された粒子の100%とすると、CMOは脂質二重膜を持つ粒子の約52.35%を表しています(図3C、下パネル)。これらのCMO染色粒子のうち、34.66%がCD9を含有し、15.49%がCD63を含有し、12.01%がCD81を含有していました。NTA制御データについては、 補足ファイル2 を参照してください。
単離されたRNAの定量データ(表2)は、3.24〜8.76(ng/μL)の範囲のレベルを示しており、これはcDNAライブラリの生成時に正規化された値です。TapeStationアッセイの結果(図4)は、約120〜160 bpの主要なピークを示し、これより小さいピークは約50 bp、その他の小さなピークは約484 bpです。
次世代シーケンシングデータの品質チェックでは、アダプタートリミング後に非常に高品質な読み取りが示されています(図5A)。すべての配列位置は&gt;30のPhredスコアを示しており、エラー率が1000ヌクレオチドに1未満であることを示しています。 図5B は、最も多くの配列が約21-22 bpであり、マイクロRNAの予想されるサイズ範囲と一致することを示しています。さらにダウンストリームマッピング(BowTie2を使用)により、Samtoolsのflagstat解析バイオツールを使用し、1,304,100の整列配列のうち、1,116,264(85%)がヒトゲノムのマイクロRNA領域にマッピングされました(build hg38; 表3)。
全 miRNA のうち、808 個の miRNA が 3 つのサンプルすべてで発現し、3 つのサンプルすべてで 344 個の miRNA が共有され(~43%)、5 個がコントロール 1 とコントロール 2 で共有され、183 個がコントロール 1 とコントロール 3 で共有され、16 個がコントロール 2 とコントロール 3 で共有されました(図 6)。このデータから、3つのBDsEVすべてで最も高い発現miRNAは、has-let-7b-5p、has-miR-143-3p、has-miR-30a-5p、has-miR-221-3p、has-let7i-5pです。同様に、BDsEVsのサンプル(リード&gt;10)で最も発現差が少ないmiRNAの上位5つは、has-miR-128-2-5p、has-miR-182-5p、has-miR-193b-5p、has-miR-448、has-miR-505-3pです。すべての未処理の読み取りカウントと正規化された読み取りカウントは、 補足ファイル 3 に記載されています。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67379/67379fig01.jpg"> 
図1:組織処理ワークフロー。 この図は、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して、新鮮凍結脳切片から脳由来sEV(BDsEV)を単離するための段階的なプロセスを示しています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67379/67379fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67379/67379fig02.jpg"> 
図2:BDsEVからのRNA単離ワークフロー。 この図は、プロテイナーゼKおよびRNアーゼAを使用して任意の細胞外RNAを除去する前処理ステップを含む、BDsEVから全RNAを単離する段階的なプロセスを示しています <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67379/67379fig02large.jpg" target="_blank">。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67379/67379fig03.jpg"> 
図3:BDsEVの特性評価ワークフロー。 この図は、BDsEVを特徴付けるさまざまな方法を示しています。(A)sEV特異的タンパク質マーカーを検出するためのウェスタンブロット。BHブレインホモジネート。カルネキシンはsEVのネガティブコントロールであり、sEVに存在しないこととBHに存在することで、sEVサンプルの純度が確認されます。他のマーカーについては、予想通り、タンパク質量は sEV サンプルよりも BH で多くなっています (ウェルあたり 20 μg のタンパク質をロード)。(B)脂質二重膜膜によるBDsEVの代表的な透過型電子顕微鏡(TEM)像(200μMスケール)。(C)すべての粒子のナノ粒子追跡分析(NTA)のサイズ分布プロット(上パネル)。各データポイントは、3回の反復間の変動を表します。生体粒子(sEV)の正規化された比率と特定の表面マーカーの相対比率(下パネル)(データはトリプリケートウェルの平均±SEM(n = 3)として示されています)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67379/67379fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67379/67379fig04.jpg"> 
図4:cDNAライブラリー調製の品質チェック。 cDNAライブラリ調製後の個々のサンプルのテーピング解析。各グラフに表示されるピークは、各調製物のサイズ(横軸、bp単位)と各ピークのそれぞれの強度(縦軸、FU)を示しています。図に示すように、予想されるsmall RNAライブラリーのピークは約120-160 bpです。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67379/67379fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67379/67379fig05.jpg"> 
図5:miRnomeシーケンシングの品質チェック。 (A)アダプタートリミング後の個々のサンプルの読み取り品質に関するFASTQCプロット。横軸はヌクレオチド位置、縦軸はPhredスコアです。各位置の箱ひげ図は、各位置のすべての読み取りにわたる Phred スコアの分布を示しています。グリーンゾーン内のすべての分布は、高品質のサンプル調製に関連する非常に高品質のデータ(&gt;Q30)を確認しています。(B)各サンプルの配列長分布は、3つのサンプルすべてについて、リードの大部分が約21-22ヌクレオチド(microRNAの予想されるサイズ範囲)であったことを示しています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67379/67379fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67379/67379fig06.jpg"> 
図6:すべてのサンプルにおけるMicroRNA発現のオーバーラップ。 各サンプルから検出されたmiRNAの数(リード数≥10)と、複数のサンプルで共有されている特定のmicroRNAがベン図に示されています。すべての生の読み取りと正規化された読み取りは、 補足ファイル 3 に表示されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67379/67379fig06large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>抗体エピトープ</td>
			<td>抗体の希釈係数 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>マウスアンチCD9</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>マウスアンチCD63</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>マウスアンチCD81</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>マウス抗フロチリン1</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>マウスアンチTSG101</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>マウス抗カルネキシン</td>
			<td>1:10 000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>抗マウス二次抗体</td>
			<td>1:3000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1:BDsEVの特性評価に用いた抗体エピトープと、それぞれの希釈係数。 
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>見本</td>
			<td>miRNA濃度(ng/μL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>8.76</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>3.24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>5.33</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2:単離されたRNAの定量データ。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>見本</td>
			<td>アラインメントされたシーケンス</td>
			<td>マッピングされた miRNA</td>
			<td>パーセンテージ (%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>コントロールサンプル1</td>
			<td>1 444 665</td>
			<td>1 133 437</td>
			<td>78.46</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>コントロールサンプル 2</td>
			<td>442 808</td>
			<td>381 631</td>
			<td>86.18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>コントロールサンプル3</td>
			<td>2 024 828</td>
			<td>1 983 726</td>
			<td>97.97</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>平均</td>
			<td>1 304 100.33</td>
			<td>1 166 264.67</td>
			<td>89.43</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表 3:アラインメントされ、正常にマッピングされた miRNA 配列の量。 
補足ファイル1:ウェスタンブロット解析の補足データ。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67379/Supplementary%20File%201.pdf" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル2:補足NTA制御データ。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67379/Supplementary%20File%202.pdf" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル3:miRNA発現解析の生および正規化されたリードカウント。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67379/Supplementary%20File%203.xlsx" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル4:補足タンパク質濃度データ。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67379/Supplementary%20File%204.pdf" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

新鮮凍結ヒト脳切片から放出される小さな細胞外小胞におけるマイクロRNAカーゴの力の利用 

Small extracellular vesicles (sEVs) are crucial mediators of cell-cell communication, transporting diverse cargoes like proteins, lipids, and nucleic ...

harnessing-power-microrna-cargoes-small-extracellular-vesicles

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

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トータルRNAの単離およびダウンストリーム次世代シーケンシングと遺伝子発現プロファイリングのための離散マウスの脳領域のマイクロダイセクションのための非レーザーキャプチャー顕微鏡のアプローチ

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