Name: 雌のショウジョウバエ・メラノガスター生殖幹細胞ニッチの長時間のライブイメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-20T13:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: 学ぶ：Drosophila melanogasterの卵巣ニッチにおける生殖幹細胞の非対称分裂を長時間ライブイメージングで観察する手法。GFP融合タンパク質を用いて細胞周期全体のスペクトロソーム動態を可視化し、幹細胞性維持メカニズムの解明に貢献します。

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原稿に対する有益なコメントをいただいたAcaimo González Reyes氏とMaría Olmedo López氏に感謝します。本研究は、PID2021-125480NB-I00 (H. S-G)、Junta de Andalucía (J. G-M) の "Ayudas a la contratación de personal Investigador Doctor"、VI and VII PPIT-Seville University (P. R-R) の "Ayuda a proyectos de investigación precompetitivos"、VI PPIT-Seville University (P. R-R) の "Contrato de Acceso de I+D+i" の支援を受けました。私たちは、元の出版物(doi:10.1242/DEV.199716)から改変された画像を共有する権利を提供してくださったCompany of Biologists Ltdに感謝の意を表します。

注:ステップ1.4は少なくとも2日前に行う必要があります。手順2.1と2.2は1日前に行うことができます。
1. 実験前の設定 I
<ol>
	<li>ストレプトマイシン/ペニシリン抗生物質ミックス(10,000 U/mLペニシリンおよび10 mg/mLストレプトマイシン)の100 μLアリコートを調製し、使用するまで-20°Cで保存します。</li>
	<li>オートクレーブ滅菌した純水を使用して15 mLの溶液を調製し、4°Cで保存し、1か月以内に使用してください:重炭酸ナトリウム(NaHCO3)0.1 M pH 8.0および0.1% Tween 20。</li>
	<li>汚染を避けるために、層流フードに次の培地と溶液を調製します。滅菌済みのフィルターチップとチューブを使用してください。
	<ol>
		<li>希釈されていないウシ胎児血清(FBS)の2 mLアリコートを調製し、無菌条件で使用するまで-20°Cで保存します。</li>
		<li>15%FBSと0.6%ストレプトマイシン/ペニシリン抗生物質ミックスを添加したシュナイダーのショウジョウバエ培地を準備します。7 mLのアリコートを調製し、4°Cで保存します。1つのアリコートは、2つのMatTekプレートに十分です(セクション2を参照)。
		<ol>
			<li>リンゲル溶液(128 mM NaCl、2 mM KCl、1.8 mM CaCl2、4 mM MgCl2、35.5 mM スクロース、5 mM Hepes、オートクレーブ純水中、pH 6.9)を調製します。1 mLのアリコートを調製し、使用するまで-20°Cで保存します。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>GFP(ポリユビキチン-mGFP6::p ar-1ライン)に融合したPar-1タンパク質を構成的かつ遍在的に発現する生後1〜2日齢のハエを、酵母粉末を添加したフライフードを含む新しいチューブに集めます。インキュベーターで25°Cで2日間培養してから解剖してください. 
	注:このステップは、蛍光タグが付けられた関心のある任意のレポーターで実行できます。</li>
</ol>
2. ガラス底板のコーティングと準備
<ol>
	<li>35 mmポリD-リジンコーティングプレート(ガラス底皿、材料表参照)のカバーガラスの中央に、特定のCell-Tak接着剤(以下、細胞および組織接着剤)を3 μL滴ずつ塗布します。滅菌チップを使用してください. 
	注:細胞および組織接着剤は4°Cで保存する必要があります。2つの遺伝的条件(通常は対照条件と変異条件)を用いた実験の場合、同じガラス底板に、十分に分離された2滴の接着剤を別々に滴下します。これにより、両方の遺伝的背景が同じ条件で画像化されるようになります。</li>
	<li>その直後に、メーカーが推奨するように等量(このプロトコールセットアップでは3 μL)の0.1 M NaHCO3 pH 8.0を3 μLの接着剤滴に慎重に加え、ピペッティングで混合します。</li>
	<li>完全に蒸発させるには、プレートを室温(RT)で20分間インキュベートし、4°Cで一晩保存して翌日使用します。あるいは、調製したプレートを37°Cで25分間インキュベートし、完全に蒸発するまでインキュベートし、直接次のステップに進みます。どちらの場合も、プレートをカバーで維持します。滅菌チップを使用してください。</li>
	<li>準備したガラス底皿をベンチに15〜20分間置いて、RTに到達させます。</li>
	<li>用意したプレートを3回丁寧に洗います。接着剤層に触れたり、邪魔したりしないでください。各洗浄で、6 μLのオートクレーブ滅菌純水を加え、3回の洗浄のそれぞれできれいなチップを使用して水を取り除き、NaHCO3溶液の残留物を除去します。</li>
	<li>ほこりの粒子を避けるために蓋をして5〜10分間解剖しながら、清潔で準備されたプレートをRTに置いて、水を完全に蒸発させます。</li>
</ol>
3. ショウジョウバエ卵巣解剖と卵巣の分離と装着
注:卵巣解剖は、サンプル組織の接着剤への付着を妨げる可能性のあるタンパク質の存在を防ぐために、FBSを含まないリンガー溶液(シュナイダー培地の代わりに)で行われます。
<ol>
	<li>開始する前に、3ウェル解剖皿、鉗子、および解剖針を70%エタノールで洗浄します。</li>
	<li>3つのウェルのそれぞれに十分な容量(~200 μL)のリンゲル溶液を加えます。</li>
	<li>2対の鉗子の助けを借りて、最初のウェルで200μLのリンゲル溶液中の5人の酵母栄養雌の卵巣を、標準的な手順に従って解剖します10,11。胸部と腹部の交差点にあるショウジョウバエの女性を鉗子の1つでつかみます。次に、後腹部のキューティクルをそっと引き裂き、2つの卵巣が露出するまで腹部のキューティクルを引っ張ります。</li>
	<li>解剖した卵巣をセカンドウェルに移し、他の組織の残骸や解剖による破片による汚染を減らします。</li>
	<li>発光ダイオード(LED)照明と細かい点の鉗子を備えた実体顕微鏡(ズーム8X-13.5X)を使用して、15〜20個の卵巣の筋肉鞘を取り外します。1組の鉗子を使用して卵巣の全身を固定し、2番目の鉗子を使用して後期の卵室をスムーズにつかみ、筋肉が壊れて遅れるまでゆっくりとストレッチします 
	注:卵巣のこの部分との接触を減らすだけで、胚葉への損傷を避けることが不可欠です。ステージ8〜9より古い卵室を取り外します。</li>
	<li>鉗子を使用して、15-20筋シースフリー卵巣を1つずつ、200μLのリンガー培地を含む3番目のウェルに移します。</li>
	<li>ピペッティングにより、20-200 μLチップを0.1% Tween 20で事前に湿らせます。これにより、卵子が先端のプラスチック壁に付着するのを防ぎます。</li>
	<li>筋被覆のない卵巣を含むリンゲル液6μLを、あらかじめ濡れた先端を使用して、調製した接着プレート(RTに保持)に移します 
	注:卵巣沈着後のゲルマリアの剥離を防ぐために、先端と接着剤層との間の接触をすべて避けてください(次のステップ)。ゲルマリアの約30%が思ったように癒着しません。</li>
	<li>転写された卵巣が接着面に付着するように、解剖針または鉗子を使用して接着面に接触するまで、リンガードロップの底まで慎重に押し下げます 
	注:卵巣が落ち着いたら、卵巣を再配置しようとしないでください。</li>
	<li>15%FBSと0.6%ストレプトマイシン/ペニシリン抗生物質ミックスを添加したシュナイダーの培地3mLをMatTekプレートに慎重に充填します(ステップ1.3)。卵巣の剥離を防ぐため、プレートの外縁に1mLずつゆっくりと加えます。</li>
	<li>筋肉鞘のない卵巣を平らな面に載せたプレートを顕微鏡ステーションに運びます。</li>
</ol>
4. 共焦点顕微鏡を用いたライブイメージング
<ol>
	<li>スピニングディスク顕微鏡または共焦点顕微鏡(同様の装置も使用可能)の63倍対物レンズにプレートを置き、サンプルの焦点を合わせます。各ガーマリウムの中央の z 平面を選択します。</li>
	<li>次の実験パラメータを設定します:キャプチャタイプ:3Dタイムラプス、レーザー出力を70/100に調整、励起波長:488 nm、Zスタックの範囲:30 μm、Zスタック間の距離:1.2 μm、持続時間:17時間、時間間隔:10分ごと。</li>
	<li>可能な場合は、マルチポジションオプションを使用して、サンプルのXY座標を再定義し、Zスタックがこの位置の中央に配置されるため、各ゲルマリウムの中央にあるZ平面を選択します。取得を開始します. 
	注:ゲルマリウムの通常の幅は30μmであるため、各Zスタックは~25-27セクションになります。共焦点にもよりますが、10分間隔で少なくとも25個のゲルマリアを画像化できます。通常、40x/1.30 NAまたは63x/1.40 NAの油浸プラナポ補正対物レンズが使用されます。</li>
	<li>ImarisまたはImageJ(フィジー)ソフトウェアを使用して、時間とZ軸で画像を解析し、スペクトロソーム形態の特定の変化を視覚化します12,13。それらの観測の特定の時間が表示されます (図 1B')。ムービーをマウントするには、各時点で最適な Z 平面を手動で選択します。</li>
</ol>

Real-Time Imaging of Germline Stem Cells in Drosophila Ex Vivo Germaria Culture

<ol><li>Li, L., Xie, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+niche%3A+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Stem cell niche: structure and function.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 21, 605-631 (2005).</li>
<li>Drummond-Barbosa, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+and+physiological+control+of+germline+stem+cell+lineages+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Local and physiological control of germline stem cell lineages in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 213 (1), e234(2019).</li>
<li>Eliazer, S., Buszczak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finding+a+niche%3A+studies+from+the+Drosophila+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Finding a niche: studies from the Drosophila ovary.</a> Stem Cell Res Ther. 2 (6), 45(2011).</li>
<li>Rojas-Ríos, P., Guerrero, I., González-Reyes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoneme-mediated+delivery+of+Hedgehog+regulates+the+expression+of+bone+morphogenetic+proteins+to+maintain+germline+stem+cells+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytoneme-mediated delivery of Hedgehog regulates the expression of bone morphogenetic proteins to maintain germline stem cells in Drosophila.</a> PLoS Biol. 10 (4), e1001298(2012).</li>
<li>Rojas-Ríos, P., González-Reyes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+the+plasticity+of+stem+cell+niches%3A+a+general+property+behind+tissue+homeostasis+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: the plasticity of stem cell niches: a general property behind tissue homeostasis and repair.</a> Stem Cells. 32 (4), 852-859 (2014).</li>
<li>Deng, W., Lin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectrosomes+and+fusomes+anchor+mitotic+spindles+during+asymmetric+germ+cell+divisions+and+facilitate+the+formation+of+a+polarized+microtubule+array+for+oocyte+specification+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Spectrosomes and fusomes anchor mitotic spindles during asymmetric germ cell divisions and facilitate the formation of a polarized microtubule array for oocyte specification in Drosophila.</a> Dev Biol. 189 (1), 79-94 (1997).</li>
<li>Huynh, J. R., Shulman, J. M., Benton, R., St Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAR-1+is+required+for+the+maintenance+of+oocyte+fate+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">PAR-1 is required for the maintenance of oocyte fate in Drosophila.</a> Development. 128 (7), 1201-1210 (2001).</li>
<li>Villa-Fombuena, G., Lobo-Pecellín, M., Marín-Menguiano, M., Rojas-Ríos, P., González-Reyes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+the+Drosophila+ovarian+niche+shows+spectrosome+and+centrosome+dynamics+during+asymmetric+germline+stem+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28Cambridge%29%22%5BJournal%5D)">Live imaging of the Drosophila ovarian niche shows spectrosome and centrosome dynamics during asymmetric germline stem cell division.</a> Development (Cambridge). 148 (18), dev199716(2021).</li>
<li>De Cuevas, M., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+of+the+Drosophila+fusome+and+its+implications+for+oocyte+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis of the Drosophila fusome and its implications for oocyte specification.</a> Development. 125 (15), 2781-2789 (1998).</li>
<li>Wong Li, C., Schedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+Drosophila+ovaries%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection of Drosophila ovaries.</a> J Vis Exp. (1), 52(2006).</li>
<li>Merkle, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection%2C+fixation%2C+and+standard+staining+of+adult+Drosophila+ovaries%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Dissection, fixation, and standard staining of adult Drosophila ovaries.</a> Methods Mol Biol. 2626, 49-68 (2023).</li>
<li>Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Image+Process%22%5BJournal%5D)">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).</li>
<li>Miura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bleach+correction+ImageJ+plugin+for+compensating+the+photobleaching+of+time-lapse+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Res%22%5BJournal%5D)">Bleach correction ImageJ plugin for compensating the photobleaching of time-lapse sequences.</a> F1000Res. 9, 95(2020).</li>
<li>Duan, T., Cupp, R., Geyer, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+female+germline+stem+cells+undergo+mitosis+without+nuclear+breakdown%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Drosophila female germline stem cells undergo mitosis without nuclear breakdown.</a> Curr Biol. 31 (7), 1602-1610 (2021).</li>
<li>Aldaz, S., Escudero, L. M., Freeman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+Drosophila+imaginal+disc+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Live imaging of Drosophila imaginal disc development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (32), 14217-14222 (2010).</li>
<li>Dye, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+and+live+imaging+of+Drosophila+imaginal+discs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cultivation and live imaging of Drosophila imaginal discs.</a> Methods Mol Biol. 2540, 275-285 (2022).</li>
<li>Sohr, A., Du, L., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+Drosophila+wing+imaginal+disc+culture+and+furin+inhibitor+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Ex vivo Drosophila wing imaginal disc culture and furin inhibitor assay.</a> Bio Protoc. 9 (16), e3336(2019).</li>
<li>Anllo, L., Plasschaert, L. W., Sui, J., DiNardo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+reveals+hub+cell+assembly+and+compaction+dynamics+during+morphogenesis+of+the+Drosophila+testis+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Live imaging reveals hub cell assembly and compaction dynamics during morphogenesis of the Drosophila testis niche.</a> Dev Biol. 446 (1), 25-34 (2019).</li>
<li>Gärthner, S. M. K., Rathke, C., Renkawitz-Pohl, R., Awe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+culture+of+Drosophila+pupal+testis+and+single+male+germ-line+cysts%3A+dissection%2C+imaging%2C+and+pharmacological+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Ex vivo culture of Drosophila pupal testis and single male germ-line cysts: dissection, imaging, and pharmacological treatment.</a> J Vis Exp. 91, e51868(2014).</li>
<li>Wilcockson, S. G., Ashe, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+ovarian+germline+stem+cell+cytocensor+projections+dynamically+receive+and+attenuate+BMP+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Drosophila ovarian germline stem cell cytocensor projections dynamically receive and attenuate BMP signaling.</a> Dev Cell. 50 (3), 296-310 (2019).</li>
<li>Jackson, J. A., Imran Alsous, J., Martin, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+nurse+cell+behavior+in+late+stages+of+Drosophila+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Live imaging of nurse cell behavior in late stages of Drosophila oogenesis.</a> Methods Mol Biol. 2626, 191-206 (2023).</li>
<li>Díaz de la Loza, M. C., Díaz-Torres, A., Zurita, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminin+levels+regulate+tissue+migration+and+anterior-posterior+polarity+during+egg+morphogenesis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Laminin levels regulate tissue migration and anterior-posterior polarity during egg morphogenesis in Drosophila.</a> Cell Rep. 20 (1), 121-133 (2017).</li>
<li>Christophorou, N., Rubin, T., Bonnet, I., Piolot, T., Arnaud, M., Huynh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-driven+nuclear+rotations+promote+meiotic+chromosome+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtubule-driven nuclear rotations promote meiotic chromosome dynamics.</a> Nat Cell Biol. 17 (11), 1388-1398 (2015).</li>
<li>Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+excitation-contraction+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cardiac excitation-contraction coupling.</a> Nature. 415 (6868), 198-205 (2002).</li>
<li>Morris, L. X., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+live+imaging+provides+new+insight+into+stem+cell+regulation+and+germline-soma+coordination+in+the+Drosophila+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary.</a> Development. 138 (11), 2207-2215 (2011).</li>
<li>Zielke, N., Korzelius, J., van Straaten, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fly-FUCCI%3A+a+versatile+tool+for+studying+cell+proliferation+in+complex+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Fly-FUCCI: a versatile tool for studying cell proliferation in complex tissues.</a> Cell Rep. 7 (2), 588-598 (2014).</li>
<li>Hinnant, T. D., Alvarez, A. A., Ables, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+remodeling+of+the+cell+cycle+accompanies+differentiation+in+the+Drosophila+germline%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Temporal remodeling of the cell cycle accompanies differentiation in the Drosophila germline.</a> Dev Biol. 429 (1), 118-131 (2017).</li>
<li>Hsu, H. J., LaFever, L., Drummond-Barbosa, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diet+controls+normal+and+tumorous+germline+stem+cells+via+insulin-dependent+and+-independent+mechanisms+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Diet controls normal and tumorous germline stem cells via insulin-dependent and -independent mechanisms in Drosophila.</a> Dev Biol. 313 (2), 700-712 (2008).</li>
<li>Andersen, D., Horne-Badovinac, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+ovarian+muscle+contraction+and+oocyte+growth+on+egg+chamber+elongation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28Cambridge%29%22%5BJournal%5D)">Influence of ovarian muscle contraction and oocyte growth on egg chamber elongation in Drosophila.</a> Development (Cambridge). 143 (8), 1375-1382 (2016).</li>
<li>Hudson, A. M., Petrella, L. N., Tanaka, A. J., Cooley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mononuclear+muscle+cells+in+Drosophila+ovaries+revealed+by+GFP+protein+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Mononuclear muscle cells in Drosophila ovaries revealed by GFP protein traps.</a> Dev Biol. 314 (2), 360-372 (2008).</li>
<li>Ables, E. T., Drummond-Barbosa, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclin+E+controls+Drosophila+female+germline+stem+cell+maintenance+independently+of+its+role+in+proliferation+by+modulating+responsiveness+to+niche+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28Cambridge%29%22%5BJournal%5D)">Cyclin E controls Drosophila female germline stem cell maintenance independently of its role in proliferation by modulating responsiveness to niche signals.</a> Development (Cambridge). 140, 4267-4276 (2013).</li>
<li>Lin, H., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+stem+cell+division+and+egg+chamber+development+in+transplanted+Drosophila+germaria%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Germline stem cell division and egg chamber development in transplanted Drosophila germaria.</a> Dev Biol. 159 (1), 140-152 (1993).</li>
</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

ここでは、ショウジョウバエメラノガスターGSCニッチを最大16時間の長期間監視するためのプロトコルを提示します。ショウジョウバエの生物学的プロセスをex vivoで撮影するためのプロトコルのほとんどは、より短い時間枠に焦点を当てており、複数の例は、想像上の翼ディスク15、16、17、胚性腺18、19、または卵巣20、21、22、23に見られます.確かに、画像取得の期間は、精査されている発達プロセスによって異なります。一過性事象は、細胞の種類および生理学的条件24に応じてミリ秒から数秒まで変化する可能性のある範囲で発生する可能性があるが、細胞分裂などの他のプロセスは、観察可能になるために数時間または数日の撮影を必要とする可能性がある。特に、ショウジョウバエの雌GSCの細胞周期は完了するまでに約12〜14時間かかります25。Villa-Fombuena et al. (2021)8では、分光体形態の変化の研究によって決定されたように、完全なサイクルの持続時間の推定値は15.5時間でした。このイメージング法とクロマチンマーカーおよび/またはFly-FUCCI技術26との組み合わせにより、GSCは通常15.5時間ごとに分裂し、細胞周期期の平均持続時間は、M(丸形、22分)、G1(丸形G1、プラグ、およびバー形、3.45時間)、S(融合形状、43分)およびG2(融合、 感嘆符、および丸い形状、10.5時間)。細胞周期段階の期間に関する生データは、Villa-Fombuena et al.8に示されています。これらの観察は、固定イメージングを使用してGSC細胞周期とフソームの形態を分析した以前の研究と一致していました25,27,28。さらに、このin vivo法は、フソームがこれらのイベントで主要な役割を果たすため、異常なGSC分裂および/または下流の卵母細胞選択におけるスペクトロソームダイナミクスの下流の結果を解読するのに役立つ可能性があります。さらに、このプロトコルは、確立された変異体または新しい変異体におけるGSC分裂率を分析するために適用できます。
長時間にわたって画像を継続的に取得することは、主に組織の完全性とその機能の維持、およびサンプルの蛍光の保存など、考慮すべき一連の重要な問題を意味します。ニッチ細胞の適切な環境条件を維持することは、機能不全、ストレス、細胞周期停止、または細胞死を回避するために不可欠です。この研究の条件では、GSCは、撮影中に12時間以上経過した後でも、組織の健康状態を示す重要なステップである有糸分裂に入る可能性があります。したがって、培養されたゲルマリアは、イメージング時間のほとんどを通じて完全性と機能性を維持していると推測されます。同様に、細胞周期全体を通じてGFP:Par-1材料が新たに生成されたため(Villa-Fombuena et al.2021を参照)8 、および画像取得を10分に1回に減らすため、ムービーの終わりに近い時点でも、分析を可能にするのに十分な信号が保持されます。いずれにせよ、サンプルの漂白は、漂白補正13などのプラグインによって補正できる可能性があります。
ex vivoで適切な環境を模倣するために、特定のサプリメントを使用して、撮影中にシュナイダー培地を使用して一定時間昆虫組織を維持することができます。重要なのは、このプロトコルは FBS 以外の成長因子やハエ抽出物を使用しないことです。以前の研究では、多くの GSC は通常 G2 で停止し、高いインスリン レベル25 によって M 期に入ることが示されました。したがって、GSC細胞周期のこの異常な刺激を避けるために、培養条件にインスリンを添加しません。FBSを解剖培地に添加すると、卵巣移植中に卵室がピペットチップまたはガラス皿に付着する可能性を減らすこともできます21。最後に、抗生物質の使用は、細菌や真菌の増殖を避けるために、長時間の映画に適しています。培養皿内の微生物の異常増殖は、組織の恒常性を変化させ、したがって細胞分裂に影響を与える可能性があります。このプロトコルでは、培地には抗生物質の混合物が含まれています(通常は1%で添加(100 U / mLペニシリンおよび100 μg / mLストレプトマイシン)。同様に、長時間のインキュベーションは抗生物質の効率に影響を与える可能性があり、抗生物質の腐敗を防ぐために培地の交換が考慮される場合があります。
ショウジョウバエは、この組織に典型的な蠕動運動、回転運動、収縮運動を防ぐために除去する必要がある管状の筋肉鞘に囲まれています29,30。したがって、この筋鞘を取り除くと、レポーター信号の観察が改善され、共焦点設定構成を使用して信号の漂白と光損傷を最小限に抑えることができ、高時間分解能の画像が可能になります。欠点としては、組織の恒常性に対する筋鞘の寄与はまだ不明です。したがって、その除去は、GSCニッチの正常な機能に何らかの影響を与える可能性があります。このシステムのもう一つの欠点は、撮影中にゲルマリアが接着剤から剥がれ、周囲の媒体に漂う可能性があることです。したがって、画像は時点内、または特定のzシリーズの取得中にさえシフトする可能性があります。この場合、ImageJ でのサンプルの動きを補正するために、レジストレーション方法12 など、さまざまなプラグインを使用できます。
要約すると、ゲルマリアのライブムービーを拡張して取得する方法を考案しました。この方法により、GSC細胞周期の詳細な定義と、分光体のダイナミクスがGSC細胞周期のさまざまな段階とどのように相関するかが可能になりましたが、プロトコルに固有のいくつかの制限を認識しています。何よりもまず、画像取得は、環境条件が in vivo 条件を正確に再現しない人工媒体で行われます。しかし、固定組織31を使用して他の著者によって報告されたものとは異なる細胞周期段階におけるスペクトロソーム形態に関して同様の結果が得られたため、このプロトコルは主に in vivo 条件を要約していると考えています。第二に、組織の完全性と機能は16時間の培養の影響を受けていないようですが、これを慎重に評価していません。理想的には、撮影したゲルマリアを女性の腹部に移植し、対照ゲルマリアが行うように新しい卵室を生成できるかどうかを評価できます32。この研究で使用されたライブイメージング法は、特に ショウジョウバエ の卵巣生物学全般において、GSCの不対称分裂の分析に貴重なツールです。さらに、このアプローチは、化合物、成長因子、または栄養素を培地に直接補充できるため、薬理学的研究に特に適しています。さらに、実験サンプルと対照サンプルを同じプレートに配置できるため、実験内の技術的なばらつきを最小限に抑えることができます。

生物学的プロセスのライブイメージングは、直接的な実験的証拠を得るのに役立ちます。高度な共焦点顕微鏡と方法論の最適化の組み合わせにより、複数の生物学的事象を高精度で探索することができます。組織の操作と解剖、サンプルの調製と保存、顕微鏡撮影の設定などのプロトコルのステップを最適化することは、得られた結果の信頼性と堅牢性を最大化するために重要です。ここでは、特にショウジョウバエのメラノガスター卵巣に焦点を当てた拡張イメージングのためにサンプルを監視するためのプロトコルを紹介します。Drosophila melanogaster卵巣は、幅広い発生過程の解析のための優れたモデルシステムです。とりわけ、ショウジョウバエのこの生殖器官であるDrosophila melanogasterには、非常に明確に定義された成虫幹細胞ニッチが含まれています。このGSCニッチは、成人期の雌性配偶子の発達を維持します。ショウジョウバエの卵巣は約18個の卵巣で構成されており、ゲルマリウムに卵腔が発達しています。各ゲルマリウムの先端では、2-4個のGSCが、主に8-10個の細胞の末端フィラメント、5-8個のキャップ細胞のロゼット、および2-3個の前方エスコート細胞によって形成される体細胞ニッチに維持されています(図1A)。この体細胞ニッチは、GSCに、その幹細胞性を維持し、増殖を制御し、分化を防ぐために不可欠なシグナルと物理的サポートを提供します1,2,3,4,5.
GSCは通常、非対称に分裂して体細胞ニッチと接触し続ける新しい幹細胞と、体細胞キャップ細胞との直接の接触を失って分化する娘細胞である嚢胞芽細胞(CB)を生成します。GSCとCBには、非常に動的で細胞質のオルガネラであるスペクトロソームが含まれており、その主な機能は、有糸分裂中の有糸分裂紡錘体の正しい向きです6。CBは不完全な細胞質分裂で4回分裂して16細胞嚢胞を発症し、生殖細胞の1つが卵子に特異的になり、他の15細胞がナース細胞になります。CBスペクトロソームは、16セルの相互接続された生殖細胞をつなぐフューソームと呼ばれる分岐構造に成長します。このスペクトロソームは、セリン-スレオニンキナーゼPar-1や膜成分Hu-li tai shao(Hts)7などの小さな小胞や骨格タンパク質に富んでいます。GSC細胞周期中、スペクトロソームは新しい材料の追加によって成長し、その形状を変化させ、G1、S、G2、およびM相の同定を可能にします（図1B)8,9。
私たちは最近、最大16時間の生きたGSCのイメージングを可能にするショウジョウバエゲルマリウムのex vivo培養法を実装しました。これらの細胞は平均して15.5時間ごとに分裂するため8、この方法ではGSC細胞周期の大部分を撮影することができます。したがって、他のツールと組み合わせることで、私たちの培養方法は、GSC細胞周期中の分光体形態の記述と、in vivo8 (図1C)での異なる細胞周期の持続時間の分析を可能にしました。ここでは、この拡張ライブイメージング法の詳細なプロトコルを、その方法論を説明するステップバイステップのガイド付きビデオで提供します（図2)によってサポートされます。

<table><tbody><tr><td>9ウェルガラスプレート</td><td>コーニング&nbsp;</td><td>7220-85</td><td>n/a</td></tr><tr><td>塩化カルシウム二水和物</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3881</td><td>CaCl2&middot;</サブ>2H<サブ>2</サブ>O;リンゲル溶液の調製には</td></tr><tr><td>、Cell-Tak</td><td>Corning&nbsp;</td><td>354240</td><td>プラスチック、ガラス、金属、FEPポリマー、生体材料など、さまざまな種類の表面に細胞や組織切片を接着するために使用される細胞および組織接着剤。</td></tr><tr><td>デュモン#5鉗子&nbsp;</td><td>ファインサイエンス</td><td>11252-20</td><td>該当なし</td></tr><tr><td>デュモン #55 鉗子&nbsp;</td><td>ファインサイエンス</td><td>11255-20</td><td>寸法 0.05 mm x 0.02 mm、長さ 11 cm</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>Gibco</td><td>10500-064</td><td>認定、熱不活性化、EU 承認、南アメリカ原産地&nbsp;</td></tr><tr><td>ガラス底皿</td><td>MatTek</td><td>P35GC-1.5-10-C</td><td>35 mm皿、No.1.5カバースリップ、ガラス径10 mm、&nbsp;ポリ-D-リジンコーティング</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4034</td><td>リンゲル液を調製するには</td></tr>塩化<tr><td>マグネシウム&nbsp;</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>M1028</td><td>MgCl2;リンガー溶液を準備するには</td></tr><tr><td>、ニードル</td><td>ホルダーRoboz&nbsp;</td><td>RS-6061</td><td>軽量、中空ステンレス製ハンドル、長さ 4 3/4 インチ。</td></tr><tr><td>ニコン SMZ18 双眼鏡&nbsp;</td><td>Nikon</td><td></td><td>https://www.microscope. healthcare.nikon.com/products/stereomicroscopes-macroscopes/smz25-smz18</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>10,000 U/mL</td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3911</td><td>KCl;リンガー溶液を調製するには</td></tr><tr><td>、シュナイダーのショウジョウバエミディアム</td><td>バイオウエスト&nbsp;</td><td>L0207</td><td>昆虫細胞用細胞培養液</td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8875&nbsp;</td><td>NaHCO3; &ge;99.5%、粉末</td></tr>塩化<tr><td>ナトリウム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9888</td><td>NaCl;リンガー溶液を調製するには、</td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>S9378</td><td>&ge;99.5%(GC);リンガー溶液を調製するにはタングステン</td></tr><tr><td>解剖ニードル</td><td>ロボズ&nbsp;</td><td>RS-6064</td><td>0.25 mm、超微細、1ミクロンチップ(Pk 10)</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9416</td><td>for molecular biology、粘性液体</td></tr><tr><td>酵母粉末</td><td>ΣAldrich</td><td>51475</td><td>n / a</td></tr></tbody></table>

雌のショウジョウバエ・メラノガスター生殖幹細胞ニッチの長時間のライブイメージング

Extended Live Imaging of Female Drosophila melanogaster Germline Stem Cell Niches

ライブイメージング法は、動的な細胞プロセスを詳細かつリアルタイムで分析することを可能にします。ショウジョウバエの卵巣は、細胞分裂、幹細胞性、分化、遊走、アポトーシス、オートファジー、細胞接着など、無数の発生過程のダイナミクスを経時的に探求するための優れたモデルです。最近では、メスのショウジョウバエGSCニッチの拡張ex vivo培養とライブイメージングを実施しました。GFP::P ar-1導入遺伝子を持つショウジョウバエ系統を例にとると、この方法では、GSCのニッチ内での非対称分裂を可視化し、細胞周期に沿ったスペクトロソーム形態の変化を記述できます。ここでは、Drosophila germariaのex vivo培養の詳細なプロトコールを提示し、メスのGSCニッチの長期にわたる可視化を可能にします。重要なことに、このプロトコルは、ストックセンターやショウジョウバエの研究コミュニティで利用可能な複数の蛍光タグ付きタンパク質を持つライブイメージングGSCに広く適用できます。

この拡張ライブイメージングプロトコルを用いることで、生物学的な乱れを与えることなく、ニッチ内における雌性GSCの非対称有糸分裂を記録することが可能です。この目的のため、GFP::Par-1タンパク質を普遍的に発現する生殖巣を使用します。これにより、GSCの細胞周期を通じて、Round、Plug、Bar、Fusing、Exclamation pointという5つの明確なスペクトロソーム形態を区別することができます（Figure 1B,C）。より詳細に説明すると、Round-G2スペクトロソームの強いGFP:Par1シグナル（Figure 1C、パネルa）は、G2-M-G1期に劇的に減少することが観察されました。重要な点として、このトランスジェニック株の使用により、GSCの有糸分裂への進入を可視化できることです。これは、前期の初期にほとんどのGFP::Par-1がスペクトロソームから離脱し、細胞質を満たすためです（Figure 1C、パネルb）。さらに、細胞質のGFP::Par-1により、核膜透過（NEP）ステップ8,14を正確に検出することが可能です。これは、この正確なタイミングでGFPシグナルが核質に進入するためです（Figure 1C、パネルb）。有糸分裂と核膜の再形成後、GFP:Par1シグナルはRound-G1スペクトロソームにおいて徐々に回復します（Figure 1C、パネルc）。Round-G1スペクトロソームへのGFP:Par1物質のDe novoな添加は、Plug（Figure 1C、パネルd）、Bar（Figure 1C、パネルe）、およびFusing（Figure 1C、パネルf）のスペクトロソーム形態の形成を促進します。最後に、GFP:Par1マーカーにより、Exclamation pointスペクトロソーム（Figure 1C、パネルe）の可視化が可能になります。これは、収縮性アクトミオシン環に加えて、細胞質分裂中に形成される微小管に富んだタンパク質構造であるミッドボディが形成された結果です。
<img alt="生殖細胞幹細胞の分化段階、スペクトロソームの形態、細胞周期段階図、顕微鏡観察。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67389/67389fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="図1"> 
図1生体GSCにおけるスペクトロソームサイクルダイナミクス。 (A末端フィラメント細胞（TFC、青）、移行細胞（TC、赤）、キャップ細胞（CpC、紫）、およびエスコート細胞（EC、灰色）で構成される生殖幹細胞（GSC）ニッチの模式図。GSC（黄色）には、スペクトロソーム（緑）と呼ばれる特徴的な細胞小器官が含まれている。GSCの細胞周期において、スペクトロソームは球状から伸長した形状へと変化し、再び球状に戻る。GSCが分裂して娘細胞であるシストブラスト（CB、オレンジ）が生成されると、CBはニッチとの接触を失い、同様に球状のスペクトロソームを保持する。CBは不完全な細胞質分裂を伴いながら、連続的に4回の同期的分裂を行い、フュソームで相互接続された2細胞、4細胞、8細胞、および16細胞のシストを形成する。B) 細胞周期中に形成される異なるスペクトロソームの形態を示す図。 (B') スペクトロソームの形態観察に要する予想時間 (C) GSCニッチにおけるGFP::Par-1シグナルを撮影した17時間のタイムラプスムービーの時系列画像。0分（0'）は核膜透過性化（NEP）に対応する。パネルは、5種類の異なるスペクトロソーム形態（白および緑の矢尻）を示している：Round（G2期およびG1期の両方；パネルaおよびc）、Plug（パネルd）、Bar（パネルe）、Fusing（パネルf）、およびExclamation point（パネルe、緑の矢尻）。後者のスペクトロソーム形態は、70分時点に示されている2番目のGSC（緑の点線）のものである。GSCは黄および緑の点線で囲まれている。GSC分裂後のCBはオレンジ色の点線で囲まれている。スケールバー： 10 µmパネルAおよびBは、Villa-Fombuenaらの許可を得て改変した。8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67389/67389fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="ショウジョウバエ卵巣小管単離のダイアグラム。手順：MatTekの準備、解剖、イメージング。生物学的手法。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67389/67389fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 2"> 
Figure 2: Drosophila 生殖巣の長時間ライブイメージングのためのCell-Tak接着剤によるマウント法。(1) 接着剤を用いたガラスボトムディッシュの準備手順。(2) リンゲル液中での Drosophila 卵巣の解剖および、個々の筋肉除去済み卵巣小管の調製概要。(3) 筋鞘を除去した卵巣小管をガラスボトムディッシュへ移す。(4) ガラスボトムディッシュに補完済みSchneider培地を満たす。(5) 倒立共焦点顕微鏡を用いて、生殖巣を10 hから16 hにわたってイメージングする。本図はVilla-Fombuenaらの論文8より許可を得て改変した。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67389/67389fig02large.jpg" target="_blank">こちらのリンクから本図の拡大版をご覧いただけます。</a>

ここでは、ショウジョウバエの卵巣ニッチにおける生殖幹細胞(GSC)の非対称分裂のライブイメージングを行うための詳細なプロトコルを提供します。私たちは、スペクトロソームタンパク質Par-1の緑色蛍光タンパク質(GFP)融合を遍在的に発現するトランスジェニックラインを使用しています。

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