Name: ヒト多能性幹細胞由来脳アッセンブロイドを用いたてんかんモデリングのための多電極アレイプラットフォーム (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-27T14:57:00.000+00:00
Duration: 6 min 30 s
Description: 学ぶ多電極アレイを用いたヒト多能性幹細胞由来脳アッセンブロイドの電気生理学的記録法。てんかんの病態メカニズムと薬物応答を体外モデルで詳細に解析する手法を習得できます。

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<meta charset="utf8"></head><body>脳集合体におけるネットワーク活動の記録:多電極アレイアプローチ

<ol><li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organogenesis+in+a+dish%3A+Modeling+development+and+disease+using+organoid+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies.</a> Science. 345 (6194), 1247125(2014).</li>
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<li>Hruska-Plochan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+of+human+neural+networks+reveals+NPTX2+pathology+in+ALS+and+FTLD%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A model of human neural networks reveals NPTX2 pathology in ALS and FTLD.</a> Nature. 626 (8001), 1073-1083 (2024).</li>
<li>Reumann, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+modeling+of+the+human+dopaminergic+system+using+spatially+arranged+ventral+midbrain-striatum-cortex+assembloids%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">In vitro modeling of the human dopaminergic system using spatially arranged ventral midbrain-striatum-cortex assembloids.</a> Nat Methods. 20 (12), 2034-2047 (2023).</li>
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<li>Dong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cerebral+organoids+establish+subcortical+projections+in+the+mouse+brain+after+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Human cerebral organoids establish subcortical projections in the mouse brain after transplantation.</a> Mol Psychiatry. 26 (7), 2964-2976 (2021).</li>
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<li>Schröter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+imaging+of+brain+organoids+using+high-density+microelectrode+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22MRS+Bull%22%5BJournal%5D)">Functional imaging of brain organoids using high-density microelectrode arrays.</a> MRS Bull. 47 (6), 530-544 (2022).</li>
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<li>Ciarpella, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+cerebral+organoids+develop+network+of+functional+neurons+and+hippocampal+brain+region+identity%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Murine cerebral organoids develop network of functional neurons and hippocampal brain region identity.</a> iScience. 24 (12), 103438(2021).</li>
<li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+application+of+brain+region-specific+organoids+for+investigating+psychiatric+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Development and application of brain region-specific organoids for investigating psychiatric disorders.</a> Biol Psychiatry. 93 (7), 594-605 (2023).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>10 cm Corning 非TC処理培養皿</td><td>Corning</td><td>08-772-32</td><td>シェーカーでの懸濁培養用</td></tr><tr><td>100 mL Beaker&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>FB100100</td><td></td></tr><tr><td>100%エタノール</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP28184-4L</td><td></td></tr><tr><td>2-メルカプトエタノール(&&beta;-ME)</td><td>サーモフィッシャー</td><td>21985023</td><td>作業濃度100&mu;M</td></tr><tr><td>48ウェル細胞培養プレート</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-202-140</td><td></td></tr><tr><td>6ウェル細胞培養プレート</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-83</td><td></td></tr><tr><td>Aggrewell 800</td><td>Fisher Scientific</td><td>501974754</td><td></td></tr><tr><td>Allegra X-14R 冷蔵遠心分離機</td><td>Beckman Coulter&nbsp;</td><td>BE-AX14R</td><td></td></tr><tr><td>アロプレグナノロン</td><td>ケイマン</td><td>16930</td><td>5mg を DMSO に懸濁して 1 mM ストック溶液を得る。分注して&-minusで凍結します。80°C.1:10,000に希釈して使用します。使用濃度100nM。</td></tr><tr><td>自動セルカウンター</td><td>Thermo Fisher</td><td>AMQAX2000</td><td></td></tr><tr><td>Axion CytoView MEA 6 ウェルプレート&nbsp;</td><td>Axion Biosystems</td><td>M384-tMEA-6B</td><td></td></tr><tr><td>Axion Maestro MEA プラットフォーム</td><td>Axion Biosystems</td><td>Maestro</td><td>温度環境制御付き</td></tr><tr><td>B-27 サプリメント (レギュラー、ビタミン A を含む)</td><td>Thermo Fisher</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>B-27 サプリメント (ビタミン A なし)</td><td>Thermo Fisher</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>基底膜マトリックス - Geltrex</td><td>Thermo Fisher</td><td>A1569601</td><td></td></tr><tr><td>ビーズバス</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>10-876-001</td><td>Isotemp</td></tr><tr><td>卓上倒立顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>CKX53</td><td>層流クリーンベンチに保管</td></tr><tr><td>Bicuculline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14340</td><td>作業濃度 10 &M</td></tr><tr><td>漂白剤</td><td>CLOROX</td><td>67619-26</td><td></td></tr><tr><td>ホウ酸塩緩衝液 20x</td><td>Thermo Fisher</td><td>28341</td><td>1x</td></tr><tr><td>BrainPhys 培地</td>での作業濃度 <td>StemCell Technologies</td><td>5790</td><td></td></tr><tr><td>細胞解離試薬 (StemPro Accutase)</td><td>Thermo Fisher</td><td>A1110501</td><td></td></tr><tr><td>Celltron オービタルシェーカー</td><td>HT-Infors</td><td>&nbsp;I69222&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>界面活性剤/酵素 (Terg-A-Zyme)</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>Z273287</td><td>使用濃度 1% m/v</td></tr><tr><td>DMEM/F12 + HEPES/L-グルタミン</td><td>サーモフィッシャー</td><td>113300</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>67685</td><td></td></tr><tr><td>ドルソモルフィン</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>P5499</td><td>5mgをDMSOに溶解して、10mMの原液を得る。分注して&-minusで凍結します。20°C.1:2000で希釈して使用します。(作業濃度 5 &M)</td></tr><tr><td>カルシウムまたはマグネシウムを含まないD-PBS</td><td>Thermo Fisher</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>グリア細胞株由来神経栄養 (GDNF)</td><td>Peprotech</td><td>450-10</td><td>溶解 100 &1mLのPBS中のgを100&μに;g/mLです。分注して&-minusで凍結します。20°C.1:5000に希釈して使用します。(使用濃度20 ng / mL)。</td></tr><tr><td>GlutaMAXサプリメント</td><td>サーモフィッシャー</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>血球計</td><td>選択顕微鏡 科学</td><td>63510-20</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>サーモフィッシャー</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>ヘラガード ECO クリーンベンチ</td><td>サーモフィッシャー</td><td>51029692</td><td></td></tr><tr><td>湿度制御細胞培養インキュベーター</td><td>サーモフィッシャー</td><td>370</td> を <td>37 度に設定;C、5%CO2</td></tr><tr><td>IWP-2</td><td>Selleckchem</td><td>S7085</td>ア<td>リコート、&-minusで凍結します。80°C。室温で解凍すると沈殿します。冷凍アリコートは、37°Cに直接配置する必要があります。使用前にC。</td></tr><tr><td>ノックアウト血清置換(KOSR)</td><td>Thermo Fisher</td><td>10828010</td><td></td></tr><tr><td>mTeSRplus(培地+サプリメント)</td><td>StemCell Technologies</td><td>100-0276</td><td>cGMP、ヒトiPS細胞用安定化フィーダーフリー培地</td></tr><tr><td>N2サプリメント</td><td>Thermo Fisher</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal A</td><td>Thermo Fisher</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>非必須アミノ酸(NEAA)</td><td>サーモフィッシャー</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>NT3</td><td>Peprotech</td><td>450-03</td><td>ディゾルブ 100 &1mLのPBS中のgを100&μに;g/mLです。分注して&-minusで凍結します。20°C.1:5000に希釈して使用します。(使用濃度20 ng / mL)。</td></tr><tr><td>NuFF ヒト新生児包皮線維芽細胞</td><td>MTI-GlobalStem</td><td>GSC-3002</td><td></td></tr><tr><td>パラフィルム</td><td>パラフィルム</td><td>P7793</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>サーモフィッシャー</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>ピペット (P10、P200、P1000)</td><td>エッペンドルフ</td><td>EP4926000034</td><td>オートクレーブカット オルガノイド採取用 P1000 チップ</td></tr><tr><td>ポリ (エチレンイミン) (PEI)</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>P3143</td><td>無菌ホウ酸緩衝液で原液を希釈する。作業濃度0.07%。詳細は原稿でご覧ください。</td></tr><tr><td>組換えヒト上皮成長因子(EGF)</td><td>R&D Systems</td><td>236-EG-200</td><td>PBS に懸濁。分注し、-20°Cで凍結します。</td></tr><tr><td>組換えヒト線維芽細胞増殖因子(FGF)-塩基性&nbsp;</td><td>ペプロテック</td><td>100-18B</td><td>はPBSで吊り下げられています。分注し、-20°Cで凍結します。</td></tr>組<tr><td>換えヒト脳由来神経栄養因子 (BDNF)</td><td>Peprotech</td><td>450-02</td><td>再構成前に短時間遠心分離します。100 & ミューを溶かします。1 mLのPBS中のgを100&μに;g/mLです。分注して&-minusで凍結します。20°C.1:5000に希釈して使用します。(使用濃度20 ng / mL)。</td></tr><tr><td>レチノイン酸(RA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R262510</td><td>mgを3.3 mLのDMSOに溶解して、100 mMのストック溶液を得る。在庫100&muを分注します。L /チューブで凍結し、&-マイナスで凍結します。80°C。200 & ミューを取ります。Lの100 mMストックを10倍に希釈し(1.8 mLのDMSOを添加)、10 mMストックを作成します。アリコート50&mu;L/チューブで保管し、&-minusで保管します。80°C.1:100,000に希釈して使用します。(使用濃度100 nM)。</td></tr><tr><td>ROCK阻害剤Y-27632</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td>10 mMストックSAG</td></tr><tr><td>(平滑化アゴニスト)</td>からの1:200Selleckchem <td></td><td>S7779</td>ア<td>リコートおよび&-minusで凍結;80°C.ストック濃度1mM。1:10,000希釈(使用濃度100 nM)で使用してください。</td></tr><tr><td>SB-431542</td><td>Tocris</td><td>1614</td><td>5mgを1.3mLのDMSOに溶解して、10 mMのストック溶液を得る。分注して&-minusで凍結します。80°C.1:1000に希釈して使用します。(作業濃度 10 &M)</td></tr><tr><td>血清ピペットフィラー</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-387-166</td><td></td></tr><tr><td>Steriflip 真空管トップフィルター</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SE1M179M6</td><td></td></tr><tr><td>滅菌細胞培養フード</td><td>Baker Company</td><td>SG-600</td><td></td></tr><tr><td>トリパンブルー溶液 (0.4%)</td><td>Thermo Fisher</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td><td>Thermo Fisher</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>ズーム実体顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>SZ61/SZ51</td><td>層流クリーンベンチに保管</td></tr></tbody></table>

ヒト多能性幹細胞由来脳アッセンブロイドを用いたてんかんモデリングのための多電極アレイプラットフォーム

A Multi-Electrode Array Platform for Modeling Epilepsy Using Human Pluripotent Stem Cell-Derived Brain Assembloids

ヒト背腹側集合体を6ウェルMEAプレート(分化あたりn = 6、分化3)に播種し、各ウェルには64個の電極が含まれていました(図2A)。縦断的記録が計画された10個のアッセンブロイドのうち9個は、in vitroで50日以上にわたって電極にしっかりと付着していました(図2D)。薬理学的アッセイ用に指定された8つのアッサンブロイドのうち6つは、開発段階に適したネットワーク活性により、ウォッシュアウトフェーズを通じて成功裏に沈殿しました(図2E)。1つの代表的なウェルからの位相差および蛍光画像が示されており(図2B)、AAV-CAG-tdTomatoで標識された背側オルガノイドとAAV-mDLX-GFPで標識された腹側オルガノイドは容易に区別できます7,9。
MEA上のニューロンの活動を解析し、さまざまなパラメータを通じて、全体的な細胞の興奮性とネットワーク活動を評価することができます。培養全体の全体的な発火率は、細胞およびネットワークの興奮性に関する情報を提供し、複数の電極間での同期バーストの頻度は、ニューロンのシナプス的に活性なネットワークの範囲を示します。空間的に異なる電極を横切って短時間に複数回繰り返されるスパイク(ネットワークバースト)は、発作様活性との生物学的相関関係として役立つ可能性がありますが、MEA上のアセンブロイドは 、真正な 発作を起こす可能性のある生物全体と比較して制限されています。 図2C は、84日目および91日目に市販の神経生理学的基礎培地で培養されたアッサンブロイドのネットワークバーストパターンを示しており、ニューロンの機能的成熟により、後の時点でバースト時間が増加する可能性があります。この場合、細胞およびネットワークの活性は、アセンブロイドがプレーティングされた日から徐々に上昇し、通常は92日目にピークに達し、125日目にほぼ衰退します(図2D)。後の段階での成熟の増加は、後の記録時点での同期バースト期間の延長に寄与している可能性があります。
GABAA 受容体拮抗薬であるBicucullineは、108日目に薬物を添加した後の有意な発火率および(ネットワーク)バースト頻度によって示されるように、アッセンブロイドの同期ネットワーク活性を増強します(図2E)。これは、以前にシングルセル電気生理学記録21で実証されたものと類似している。薬理学的アッセイの検出力分析は、G*Power3 ベースを使用して、効果サイズ 0.94、アルファ値 0.05 で実施されました。0.8の検出力を達成するためには、n = 5の3つの等しいサイズのグループを持つ15個のアッサンブロイドの合計サンプルが必要でした(図2E)。応答が真の信号イベントであり、少量のメディアの追加から生じる可能性のある信号強度の変化ではないことを確認するための車両制御が含まれています(図2E)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67396/67396fig01.jpg"> 図1:調査の概要。 重要な段階および対応する低分子の補足を詳述する分化プロトコルのMEAタイムライン上の二重標識アッサンブロイドの生成およびめっきのためのプロトコル(組成に関する追加情報については、 表1 および 材料の表を参照)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67396/67396fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67396/67396fig02.jpg"> 図2:アッサンブロイドのMEA記録 (A)82日目、すなわちめっき後10日目における単一のMEAプレート(n = 6ウェル)からの平均焼成活動のヒートマップ。すべてのウェルは、同じ条件と遺伝子型の培養物を表しています。(B)アッサンブロイドの代表的な位相コントラストおよび共焦点画像、背側アッセンブロイドは赤で、腹側は緑でラベル付けされています。白い矢印は、腹側から背側へのGABA作動性介在ニューロンの移動を示しています。スケールバー = 500 μm. (C) 代表的なラスターは、1つのウェルから120秒を超える記録時間をプロットします。ネットワークバーストは紫色のボックスで強調表示されます。78日目(めっきの1週間後、記録開始日)と92日目(めっきの3週間後、活動がピークに達する日)の2つの別々の時点が示されています。(D)78日目から127日目までの平均発火率、バースト頻度、およびネットワークバースト頻度の定量化(n = 3微分、3アッサンブロイド/微分)。各曲線は、3つの微分(色分け)からコンパイルされた1つの個々の集合体を示します。赤い曲線は平均値を示しています。(E)バイキュクリンアッセイ結果の定量化(n = 6アッセンブロイド/条件)。棒グラフはSEM±平均として表示されました。各ドットは、3つの分化(色分け)からコンパイルされた1つの集合体を表します。ノンパラメトリックなフリードマン検定を実行しました。**p &lt; 0.01;ns、重要ではありません。MEA、多電極アレイ。ヒートマップとラスタープロットは、分析ソフトウェアNeural Metric Toolを使用して生成されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67396/67396fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
表1:さまざまな差別化段階にあるメディアのコンポーネント。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67396/67396_Table%201.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

Human brain organoids are three-dimensional (3D) structures derived from human pluripotent stem cells (hPSCs) that recapitulate&#160;aspects of fetal ...

a-multi-electrode-array-platform-for-modeling-epilepsy-using-human

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

このビデオは、ヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)に由来するニューロンの電気生理学的活動を記録するために、微小電極アレイ(MEA)を使用する方法を示しています。ニューロン-アストロサイト共培養物を含むマルチウェルMEAからの電気生理学的活性は、ネットワーク内の複数のニューロンからの活動電位を検出するために記録され、hiPS細胞のニューロンへの分化が成功したことを確認しています。...

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このビデオでは、多電極アレイ(MEA)を使用して3D共培養球のシナプス生理機能を測定する手順を示しています。この方法により、3D球体内のニューラルネットワークダイナミクスとシナプスネットワークバースト活動を理解することができます。...

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人間の死体をホルマリン固定モデルを用いた皮質微小電極アレイの注入の手術トレーニング

このプロトコルの結合解離ひと多能性幹細胞由来神経細胞の再現性のある手法を目指して、アストロ サイト 3 D...

ひと多能性幹細胞からのニューロンとアストロ サイトの三次元共培養系によるシナプス局所回路におけるモデリング

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リナル皮質-海馬の組織性スライス培養におけるてんかん発生のモデル

ヒト誘導多能性由来のアストロサイトとニューロンおよびそれらの共培養を電気生理学的記録のために脊髄に分化させる方法を記載する。...

領域特異的ヒト多能性幹細胞由来アストロサイトおよびニューロンを用いたALSモデリングのための電気生理学的基盤の確立

本研究では、HD-MEAを用いて、特に海馬、嗅球回路、ヒト神経回路における大規模な神経集団の計算ダイナミクスを掘り下げます。時空間活動を捉え、計算ツールと組み合わせることで、ニューロンのアンサンブルの複雑さに関する洞察を得ることができます。この手法は、脳機能の理解を深め、神経疾患のバイオマーカーや治療法を特定できる可能性がある。...

CMOS集積高密度微小電極アレイにおけるマルチモーダル大規模神経集団ダイナミクスの記録と解析

学ぶ多電極アレイを用いたヒト多能性幹細胞由来脳アッセンブロイドの電気生理学的記録法。てんかんの病態メカニズムと薬物応答を体外モデルで詳細に解析する手法を習得できます。

ヒト多能性幹細胞由来脳アッセンブロイドを用いたてんかんモデリングのための多電極アレイプラットフォーム

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