Manuka Honeyで処理された創傷原因細菌の生存細胞が培養できない細胞を定量するための生死染色

この研究プロジェクトは、マヌカハニーが細菌の生理機能に及ぼす影響を調査することを目的としています。最近の研究では、マヌカハニーの抗菌効果が細菌の生理機能に及ぼすさらなる洞察が得られました。私たちの予備的な調査結果は、マヌカハニーバクテリアが抗生物質耐性、生存可能だが培養可能ではない休眠状態に入ることを示していますが、従来の抗生物質で治療されたものよりも程度は低いです。

私たちの実験に基づいて、マヌカハニーと従来の抗生物質誘導VBNCの発現プロファイルを比較することは興味深いでしょう。まず、凍結細菌株が入ったバイアルを取ります。それぞれを順番に開き、滅菌スティックを使用して、適切にラベル付けされたLuria-BertaniまたはLB寒天プレートに少量の凍結細菌をこすり落とします。

バイアルキャップを元に戻し、すぐに冷凍庫に入れます。細菌培養物を摂氏37度で18〜24時間インキュベートします。翌日、血清学的ピペットを使用して、2ミリリットルのLBブロスを2つの滅菌試験管に移します。

ブンゼンバーナー炎の接種ループを滅菌します。次に、LB寒天プレートから4分の1ループの細菌をLBブロスを含む適切にラベル付けされた試験管に移します。好気性条件下で、摂氏37度で約250rpmの振とうインキュベーターで試験管を18〜24時間インキュベートします。

マヌカ蜂蜜および細菌の抗生物質処置のためのセットアップのために、Mueller Hintonのスープの10ミリリットルに細菌の培養物の10マイクロリットルを加えて、1ミリリットルあたり約10から第6のコロニー形成単位を有する細菌培養物の1:1、000の希釈を得る。希釈した培養物を使用して、各細菌種、未処理のコントロール、マヌカハニー処理サンプル、および抗生物質処理サンプルの3つのサンプルを調製します。マヌカハニーと抗生物質を適切なチューブに加えます。

未処理のサンプル0.1ミリリットルと0.5ミリリットルを滅菌マイクロ遠心チューブに移し、生肉数と生死染色を行うと、Tはサンプルがゼロに等しくなります。次に、未処理のコントロール、マヌカハニー処理、および抗生物質処理したサンプルを、摂氏37度の好気性条件下で、250 RPMの振とうインキュベーターで24時間インキュベートします。LBブロス中の未処理サンプルがゼロに等しいTの10倍の段階希釈を準備して、生菌プレートカウントの可算細胞数を取得します。

希釈した各サンプルの50マイクロリットルをLB寒天プレートの半分に広げます。寒天プレートを37°Cの好気性条件下で24時間インキュベートします。翌日、LB寒天プレートをインキュベーターから取り出します。

約25〜150のコロニーを含む希釈プレートを特定し、コロニーの正確な数を数えます。コロニー形成単位式を使用して、ミリリットルあたりの培養可能な細胞の数を決定します。3日目に、0.5ミリリットルの0.85%塩化ナトリウムを0.5ミリリットルのTに加えて、未処理の生/死染色コントロールサンプルをゼロにします。

サンプルごとに1.5マイクロリットルのSYTO 9と1.5マイクロリットルのヨウ化プロピジウムを組み合わせます。次に、各サンプルに3マイクロリットルの混合物を追加します。サンプルを摂氏21度で暗所で15分間インキュベートします。

染色した穏やかに混合したサンプルの6マイクロリットルを使い捨て血球計算盤に移し、フルオレセインイソチオシアネートまたはFITCフィルターと40倍対物レンズを使用して蛍光顕微鏡で観察します。血球計算盤のグリッド線と緑色の細胞の両方を示す画像をキャプチャします。サンプルごとに 6 つのフィールドの緑のセルをカウントし、体積あたりの緑のセルの数を計算するためのグリッドの寸法に注意してください。

最後に、生/死染色を用いて得られた1ミリリットル当たりの生細胞数から、生菌プレート数を用いて得られた1ミリリットル当たりの培養可能細胞数を差し引くことにより、生存可能だが培養不能な細胞の数を計算する。4日目に、未処理のマヌカハニー処理した細菌培養物、および抗生物質処理した細菌培養物をインキュベーターから取り出した後、各サンプルの0.1ミリリットルと0.5ミリリットルをマイクロ遠心チューブに収集して、生存プレート数と生/死染色を行います。この図は、黄色ブドウ球菌および緑膿菌の培養物の生肉数と生死染色を用いて決定された培養細胞と生存細胞の数を示しています。

その結果、未処理の培養物とマヌカハニー処理した培養物で検出された生細胞と培養可能な細胞の数は有意差がなかったことが示されています。黄色ブドウ球菌をトブラマイシンで処理した培養細胞は、生細胞よりも培養可能細胞が少なかったが、この差は有意ではなかった。緑膿菌を治療したメロペネムのみが、生細胞と比較して培養可能細胞の統計的に有意な減少を示しました。