アガロースゲルベースの​​マイクロ流体デバイスを用いた神経幹細胞運動の評価

こんにちは、ケビンが勝ったです。私はコーネル大学のBiofluids Labで工学の修士課程の学生です。そして今日は、Agrosベースのマイクロ流体デバイスを使用して、Maureen神経幹細胞に対するEGF上皮成長因子の効果を研究する方法についてお話しします。

このデバイスは基本的に、それぞれ幅が150ミクロンの3つのマイクロ流体チャネルで構成されています。EGFは一方のサイドチャネルにポンプで送られ、バッファーはもう一方のサイドチャネルにポンプで送られます。基本的には、中央チャネルを横切る静的な線形化学勾配を設定します。

EGFの拡散はアグロゲルを介して容易に拡散するため、ニューロン幹細胞は中央チャネルに播種され、その移動の進行は顕微鏡で監視されます。したがって、デバイスは基本的に、チューブに接続するためのすべての入口と出口を備えたプレキシガラスの最上層で構成されています。そしてその下にはアグロゲルメンブレンがあり、その中に4つのパターンデバイスがあります。

これはPDMSスペーサーで囲まれているため、デバイス全体にわたって一定の厚さが保証されます。PDMSとゲルは、ectでコーティングされたスライドガラス上に組み立てられます。これにより、細胞がスライドガラスに付着するのを助けます。

また、本体全体を取り付けたのはステンレス板で、ネジで挟み込みます。野生型細胞株にはレトロウイルスベクターをトランスフェクションして野生型EGF受容体を過剰発現させ、デルタ細胞株にはEGF受容体の変異型をトランスフェクションして、EGFリガンドなしで構成的に活性にすることができます。では、まず、マイクロ流体デバイスの組み立てプロセスについてご説明します。

そこで、まずPDMSスペーサーをマスターのシリコンマイクロチャネルのレリーフ機能の周りに配置しました。だから今、私は0.3グラムのアグロの重さを量るつもりです。そこで、10ミルのCO2非依存培地を取り出し、それをアグロスに加えます。

そして、アロスパウダーとCO2に依存しない培地を混ぜるために、ピペで上下します。これで、電子レンジの準備が整いました。ご覧の通り、アグロスは液化されていますが、まだ顆粒が少し残っています。

これをぐるぐる回して顆粒を溶かし、気泡を消してみます。そこで、溶融したアグロスをシリコンマスターのレリーフ機能に注ぎ、次に滅菌ガラススライドを取り、PDMSスペーサーの上に置きます。そして、アグロジェルの中の気泡のほとんどを押し出すように斜めに置きました。

そして、私は圧力をかけました、そして私はアグロスの殻が固まるまで圧力をかけ続けます。だから1〜2分後には固まっています。次に、スライドから余分なアグロスを取り除きます。

次のステップは、スライドガラスをそっとスライドさせて、このスライドガラスを廃棄することができます。次に、パターンarosを以前にフィブロネクチンでコーティングしたスライドガラスに優しく転写してみます。基本的には、このプラスチック製滅菌シートを使用して、PDMM MSスペーサーでパターンアグロスを持ち上げ、チャネルをスライドに向かってパターンアグロスを移します。

これがスライドガラスにしっかりと固定されたので、プラスチックマニホールドがチャネルにアクセスできるように、個々のリザーバーに穴を開けます。これは小さな金属製の穴あけパンチャーを使用して行います。これで、デバイスに穴を開けることができました。

マイクロチャネルの乾燥を防ぐために、500マイクロリットルのCO2非依存メディアを追加し、1〜2分間放置します。さて、1〜2分後、余分なメディアを排出しようとし、次にパターンアグロスに打ち込まれた穴をプレキシガラスマニホールドの入口と出口の穴に合わせます。そして、穴が揃ったら、しっかりと押してきれいにシールします。

次に、プレキシガラスマニホールドをステンレス鋼のマウントに置き、次にネジを使用してデバイスをそっと挟み込みます。ネジを締めすぎないように細心の注意を払っています。これはチャネルを押しつぶすため、パターンのアグロスゲルの内側がスロットになるのを防ぐためにネジを時計回りに配置します。1ミルのメディアを引き出し、この注射器を使用してデバイスをテストします。

ご覧の通り、各マイクロチャネルに液体を注入し、各出口から液体が出てくるのを探しています。そこで、今、組み立てたデバイスを顕微鏡の環境チャンバーに入れました。これは摂氏37度に維持されるため、これによりデバイスがウォームアップされ、細胞を播種する必要があるときに準備が整います。

ご覧のとおり、パラソルポンプのチューブをセットアップに通す2つをすでに通しています。そして、私は現在、実験の準備としてチューブをPBSで洗い流しています。では、チューブをセットアップします。

パラソルポンプチューブを、すでに穴が開けられているキャップに通します。そして、各チューブには、チューブの入口と出口の両方を識別できるように、特定の数のノッチがあります。したがって、4つのノッチが付いたチューブは、1ミルあたり10ナノグラムを受け取ります。

EGF溶液は、チューブをデバイスに接続します。そこで、ノッチの数に応じて各デバイスに取り付けます。つまり、それが取り上げている解決策に対応するのです。

そして今、アウトレットチューブを取り付けます。透明なタイゴンチューブを使用して、メディアが実際に出口チューブを通って流れていること、およびチャネルに詰まりがないことを確認します。そして今、パラソルポンプを始動します。

それでは、細胞を中央チャネルに播種する手順を開始します。まず、センサーチャネルの余分なメディアを取り出します。それでは、セルを見ていきます。

細胞はすでにCO2非依存性培地に懸濁しています。そして、私は売られ、センターチャネルの入口に60席、出口に20マイクロリットル座っていました。そして、うまくいけば、細胞は重力駆動の流れによって座ります。

そして、他の2つの感度の高いチャンネルについてもこの手順を繰り返し、今度は顕微鏡で観察して、細胞の着座が成功したかどうかを確認します。これで、細胞はスライドガラスに付着し、数分後には細胞が広がり始め、独自の形態になります。そこで今日は、実際のデバイスの組み立て、試薬の準備、デバイス内の細胞移動を画像化するために使用する顕微鏡技術について説明しました。

結論として、このデバイスが、特に臨床現場で、はるかに広範な放棄を行うことを願っています。したがって、水平に1つを図ってください。C 17.2細胞の軌跡とEGF濃度の上昇を垂直方向に示しています。

これは、同じEGF濃度での実験で使用したC 17.2細胞のさまざまな株の軌跡を示しています。親細胞のデータは、10ナノグラム/milのEGF濃度勾配で運動性のピークがあることを示しており、より高いEGF濃度で受容体がリガンドで飽和していることを示しています。また、野生型のデータによると、100ナノグラム/milの濃度(EGF)で運動性が増加することが示されています。

これは、受容体が高濃度のEGFで飽和しないことを示しています。これは、EGF受容体を過剰発現するように設計されているため、理にかなっています。最後に、デルタ細胞株のデータは、細胞の運動性がEGF濃度とほぼ無関係であることを示しています。

変異したEGF受容体は、EGFの存在とは無関係に活性化されるように設計されているため、これも予想されます。