Name: アテローム性動脈硬化症における大動脈組織の三次元イメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: 学ぼう、組織透明化と3Dイメージングを用いたマウス大動脈の可視化手法。末梢神経系とアテローム性動脈硬化プラークの構造関係を解明し、心血管疾患の病態理解と治療開発への応用を目指す。

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<meta charset="utf8"></head><body>マウス大動脈の3Dイメージングのための最適化された組織透明化プロトコル

<ol><li>Libby, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+changing+landscape+of+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The changing landscape of atherosclerosis.</a> Nature. 592 (7855), 524-533 (2021).</li>
<li>Mohanta, S., Yin, C., Weber, C., Hu, D., Habenicht, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aorta+atherosclerosis+lesion+analysis+in+hyperlipidemic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Aorta atherosclerosis lesion analysis in hyperlipidemic mice.</a> Bio Protoc. 6 (11), e1833(2016).</li>
<li>Yin, C., Mohanta, S. K., Srikakulapu, P., Weber, C., Habenicht, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artery+tertiary+lymphoid+organs%3A+Powerhouses+of+atherosclerosis+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Artery tertiary lymphoid organs: Powerhouses of atherosclerosis immunity.</a> Front Immunol. 7, 387(2016).</li>
<li>Mohanta, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artery+tertiary+lymphoid+organs+contribute+to+innate+and+adaptive+immune+responses+in+advanced+mouse+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Artery tertiary lymphoid organs contribute to innate and adaptive immune responses in advanced mouse atherosclerosis.</a> Circ Res. 114 (11), 1772-1787 (2014).</li>
<li>Carmeliet, P., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+mechanisms+of+nerve+and+blood+vessel+wiring%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Common mechanisms of nerve and blood vessel wiring.</a> Nature. 436 (7048), 193-200 (2005).</li>
<li>Mohanta, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroimmune+cardiovascular+interfaces+control+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neuroimmune cardiovascular interfaces control atherosclerosis.</a> Nature. 605 (7908), 152-159 (2022).</li>
<li>Mohanta, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiovascular+brain+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Cardiovascular brain circuits.</a> Circ Res. 132 (11), 1546-1565 (2023).</li>
<li>Hu, D., Yin, C., Luo, S., Habenicht, A. J. R., Mohanta, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+smooth+muscle+cells+contribute+to+atherosclerosis+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Vascular smooth muscle cells contribute to atherosclerosis immunity.</a> Front Immunol. 10, 1101(2019).</li>
<li>Newland, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type-2+innate+lymphoid+cells+control+the+development+of+atherosclerosis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Type-2 innate lymphoid cells control the development of atherosclerosis in mice.</a> Nat Commun. 8, 15781(2017).</li>
<li>Grabner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphotoxin+beta+receptor+signaling+promotes+tertiary+lymphoid+organogenesis+in+the+aorta+adventitia+of+aged+Apoe-%2F-+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Lymphotoxin beta receptor signaling promotes tertiary lymphoid organogenesis in the aorta adventitia of aged Apoe-/- mice.</a> J Exp Med. 206 (1), 233-248 (2009).</li>
<li>Mai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+cellular+mapping+in+mouse+using+standard+igg+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Whole-body cellular mapping in mouse using standard igg antibodies.</a> Nat Biotechnol. 42 (4), 617-627 (2024).</li>
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<li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+imaging+with+single-cell+resolution+by+tissue+decolorization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization.</a> Cell. 159 (4), 911-924 (2014).</li>
<li>Tian, T., Yang, Z., Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+clearing+technique%3A+Recent+progress+and+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Anat%22%5BJournal%5D)">Tissue clearing technique: Recent progress and biomedical applications.</a> J Anat. 238 (2), 489-507 (2021).</li>
<li>Adolfs, Y., Raj, D. D. A., Brignani, S., Pasterkamp, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+tissue+clearing+and+3d+analysis+of+dopamine+neurons+in+the+developing+mouse+midbrain%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for tissue clearing and 3d analysis of dopamine neurons in the developing mouse midbrain.</a> STAR Protoc. 2 (3), 100669(2021).</li>
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<li>Cao, Y., Wang, H., Wang, Q., Han, X., Zeng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+volume+fluorescence-imaging+of+vascular+plasticity+in+adipose+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Metab%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional volume fluorescence-imaging of vascular plasticity in adipose tissues.</a> Mol Metab. 14, 71-81 (2018).</li>
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<li>Bhatia, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+proteomics+in+three-dimensional+intact+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Spatial proteomics in three-dimensional intact specimens.</a> Cell. 185 (26), 5040-5058.e19 (2022).</li>
<li>Mai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+tissue+labeling+and+clearing+of+intact+human+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Scalable tissue labeling and clearing of intact human organs.</a> Nat Protoc. 17 (10), 2188-2215 (2022).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>2,2'-チオジエタノール(TDE)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>166782</td><td>Clearing試薬</td></tr><tr><td>Amira</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>3D可視化ソフトウェア。3D画像の手動セグメンテーションとトレースに使用される画像処理ソフトウェア</td></tr><tr><td>ベンジルアルコール</td><td>シグマ&nbsp;</td><td>W213713</td><td>クリアリング試薬</td></tr><tr><td>安息香酸ベンジル</td><td>Σ</td><td>B6630</td><td>クリアリング試薬</td></tr><tr><td>CD16/32</td><td>eBioscience</td><td>14-0161-82</td><td>ブロッキングソリューション</td></tr><tr><td>共焦点レーザー走査型顕微鏡&nbsp;</td><td>ライカマイクロシステムズ</td><td>TCS- SP8 3X</td><td>イメージングデバイスは、細胞内分解能で高い特異性を持つ無傷の生体組織または切片を多次元高解像度でイメージングします。</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>インビトロジェン</td><td>D3571</td><td>核マーカー</td></tr><tr><td>ジクロロメタン(DCM)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>270997</td><td>透明化試薬</td></tr><tr><td>パンブラックワックスの解剖&nbsp;</td><td>サーモサイエンティフィック&nbsp;</td><td>S17432</td><td>大動脈解剖と固定&nbsp;</td></tr><tr><td>解剖実体顕微鏡</td><td>ライカマイクロシステムズ&nbsp;</td><td>Stemi 2000</td><td>マウス臓器解剖</td></tr><tr><td>エタノール&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>E7023</td>の<td>離脱&nbsp;</td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸(EDTA)</td><td>Roth&nbsp;</td><td>8040.1</td><td>灌流バッファ&nbsp;</td></tr><tr><td>フィジー&nbsp;</td><td>(ImageJ, NIH)</td><td></td><td>2Dおよび3D画像用のオープンソース画像処理ソフトウェア</td></tr><tr><td>Goat anti-Hamster IgG, Cy3</td><td>Dianova&nbsp;</td><td>127-165-099</td><td>二次抗体</td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギIgG, Alexa Fluor 680</td><td>Thermo Fisher Scientific / Invitrogen</td><td>A-21109</td><td>二次抗体&nbsp;</td></tr><tr><td>ヤギ抗ラットIgG、Cy5</td>ダイ<td>アノバ</td><td>712-175-150</td><td>二次抗体</td></tr><tr><td>ハムスター抗CD3e&nbsp;</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>145-2C11&nbsp;</td><td>Pan-T細胞マーカー</td></tr><tr><td>Huygens Professional</td><td>Scientific Volume Imaging、オランダ</td><td>バージョン19.10</td><td>画像復元ソフトウェア。主に2Dおよび3D画像のデコンボリューションに使用される画像処理ソフトウェア</td></tr><tr><td>画像処理ワークステーション</td><td>MIFCOM&nbsp;</td><td>MIFCOM X5</td><td>LeicaアプリケーションスイートX、フィジー、イマリスを含むすべての画像処理ソフトウェアを搭載した画像処理ワークステーションで、共焦点顕微鏡、多光子顕微鏡、ライトシート顕微鏡で取得した画像の後処理が</td></tr>可能 <tr><td>イマリス</td><td>ビットプレーン</td><td>バージョン8.4</td><td>画像解析ソフトウェア。3D画像の自動セグメンテーションに使用される画像処理ソフトウェア</td></tr><tr><td>インキュベーターとローテーター&nbsp;</td><td>マーシャル・サイエンティフィック&nbsp;</td><td>Innova 4230</td><td>組織 クリアリング中のインキュベーションおよび回転装置&nbsp;</td></tr><tr><td>iSpacer</td><td>Sunjin Lab</td><td>IS4020</td><td>Rectangular well as the sample holder</td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Livisto</td><td></td><td>Anesthetic</td></tr><tr><td>Leica Application Suite X (LAS-X)&nbsp;</td><td>ライカマイクロシステムズ</td><td>バージョン3.5</td><td>ライカ顕微鏡で取得した画像用画像処理ソフトウェア</td></tr><tr><td>光顕微鏡</td><td>ライカマイクロシステム</td><td>ズDM LB</td><td>明るいフィールドイメージング用イメージングデバイス</td></tr><tr><td>ライトシート&nbsp; 顕微鏡</td><td>LaVision BioTech</td><td>Ultramicroscope II</td><td>薄い光学切片の画像を迅速に取得することにより、光の少ない露出で大きな生体試料やマウス全体を高速かつ高解像度でイメージングするためのイメージング技術。</td></tr><tr><td>多光子顕微鏡</td><td>ライカマイクロシステムズ</td><td>TCS-SP5II MP&nbsp;</td>無<td>傷で生存可能な生体組織を細胞内および分子レベルで長期間にわたって、サンプルの深部で最小限の浸潤で多次元かつ高解像度にイメージングするためのイメージングモダリティ。</td></tr><tr><td>通常のヤギ血清&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G9023</td><td>ブロッキング溶液</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド(PFA)&nbsp;</td><td>シグマ&nbsp;</td><td>P-6148&nbsp;</td><td>固定&nbsp;</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水(PBS)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P4417-100タブ&nbsp;</td><td>洗浄バッファー</td></tr><tr><td>豚皮ゼラチン</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>G1890</td><td>インキュベーションバッファー</td></tr><tr><td>Quadrol</td><td>Sigma</td><td>122262</td><td>CUBICクリア試薬</td></tr><tr><td>ウサギ抗NF200</td><td>Σ</td><td>N4142</td><td>汎神経マーカー</td></tr><tr><td>ラット抗B220&nbsp;</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>RA3-6B2</td><td>Pan-B細胞マーカー</td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>シグマ&nbsp;</td><td>90M003524V&nbsp;</td><td>脱水症状&nbsp;</td></tr><tr><td>Sytox</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S11380</td><td>核マーカー</td></tr>テ<tr><td>トラヒドロフラン</td><td>シグマ&nbsp;</td><td>401757</td><td>清算試薬&nbsp;</td></tr><tr><td>トリトンX-100</td><td>ロス&nbsp;</td><td>3051.1</td><td>浸透</td></tr><tr><td>尿素</td><td>シグマ&nbsp;</td><td>U5128</td><td>CUBICクリア試薬</td></tr><tr><td>キシレン&nbsp;</td><td>フィッシャーケミカル&nbsp;</td><td>x/0250/17&nbsp;</td><td>麻酔&nbsp;</td></tr></tbody></table>

アテローム性動脈硬化症における大動脈組織の三次元イメージング

Three-Dimensional Imaging of Aortic Tissues in Atherosclerosis

無傷の健康な大動脈と罹患した大動脈の微小解剖学的構造を実証し、アテローム性動脈硬化症のマウスモデルにおける免疫系、神経系、心血管系の間の物理的結合を明らかにするために、単離された大動脈のTDE除去とマウス全体のiDISCO除去という2つの補完的な組織透明化アプローチを使用しました(図1)。ホールマウント免疫染色後、 enface aortaを一連のTDEワーキングソリューションでクリアしました。RIは、最終ステップのTDE濃度に応じて1.4〜1.5に一致し、大動脈組織の体積を変えることなく大動脈組織の最適な透明性を実現します(図1A)。TDEクリアリングとは異なり、iDISCOのクリアリングプロトコルには、ホールマウント免疫染色前の脱色および透過化ステップが含まれ、その後、異なる化学溶媒を使用した脱脂および脱水、および1.56でのRIマッチングが含まれます(図1B)。iDISCOのクリアリングは、組織の縮小により、大きなサイズの組織やマウスの全身まで可視化することができます。
TDEクリアされた顔 面 大動脈全体の共焦点および多光子3Dイメージングは、内膜プラーク、外膜細胞性、外膜神経突起などの構造を可視化することができ、iDISCOクリアマウスのライトシートイメージングは、動脈樹、血管周囲脂肪組織、腎リンパ節、神経や神経節などの関連神経成分の可視化と再構築を可能にします(図1C)。)。例えば、TDEでクリアされたアテローム性動脈硬化性大動脈の共焦点イメージングでは、プラーク中の複数のCD3e染色T細胞が検出され、ATLOではNF200染色された直径の異なる神経線維の広範な新生が検出されましたが、TDEの多光子イメージングでは、老化したApoe-/- マウスのホールマウント病変腹部大動脈がクリアされ、ATLO内のB220陰性T細胞領域にNF200発現軸索の発芽の縄張り性が示されました(図2A)。).一方、マウス腹部全体を透明化したiDISCOのライトシートイメージングでは、大動脈と隣接する交感神経節との空間的関係が可視化されました。神経節から大動脈表面までの個々の軸索の3D画像セグメンテーションと追跡により、アテローム性動脈硬化症プラークに隣接する大動脈外膜に新たに形成されたNF200染色軸索を含む、強力なニューロン再構築が明らかになりました(図2B)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67400/67400fig01.jpg"> 
図1:試験のワークフロー。 (A) enに面した 大動脈の水性ベースのTDEクリアリング。(B)マウス全体の溶媒ベースのiDISCOクリア。(C)光学的にクリアされた孤立した大動脈またはマウス全体のサンプルの体積イメージングおよび画像処理. 3D。 この図は、Sun et al.17の許可を得て変更されています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67400/67400fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67400/67400fig02v2.jpg"> 
図2:TDEとiDISCOがクリアした組織の3D画像の例(A)顔面大動脈でTDEがクリアされた3D画像。上パネル:共焦点画像は、内膜プラークのCD3e + T細胞(赤、矢印)とアテローム性動脈硬化性大動脈外膜(ATLO)のNF200 +神経軸索(緑)を示しました。下段:78週齢の雄Apoe-/-マウスのATLOにおいて、NF200+神経軸索(緑、矢印)、B220+ B細胞(赤、白)、コラーゲン由来の第2高調波発生(SHG、白)が多光子画像で示されました。Sytox(青)とDAPI(青)は核を示しました。(B)iDISCOの3D再構成およびセグメント化された画像は、マウスの腹部全体を透明にしました。NF200+神経と軸索(矢印、緑)のライトシート3D再構成、セグメンテーション、トレース、および無傷の腹部大動脈の交感神経節(矢印)との空間的関係。白三角形は、アテローム性動脈硬化症のプラークに隣接して新たに形成された軸索を示しました。自家蛍光(自動)を使用して、大動脈とプラーク(シアン)や腎リンパ節(RLN、青)などの結合組織を画像化しました。CG、腹腔神経節、SycG、交感神経鎖神経節。この図は、Mohanta et al.6 および Sun et al.17 の許可を得て修正されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67400/67400fig02largev2.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

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three-dimensional-imaging-of-aortic-tissues-in-atherosclerosis

Research

JoVE Journal

Biology

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