可視から短波赤外までの生体吸収スペクトルの特性評価

私たちの研究室では、妊産婦の健康アプリケーションのための診断情報を提供する光ベースのツールを開発しています。私たちがよく光分光法を使用するのは、妊娠中にモニタリングすべき重要な生理学的パラメータである血中酸素化やヘモグロビン濃度のモニタリングなど、非侵襲的に提供できる健康関連情報が豊富にあるためです。粒子状水中の一部の溶媒は、目的の溶質を覆い隠す可能性のある強い吸収を持っています。

さらに、VIS-SWIR領域にまたがるスペクトルは、異なる波長範囲で吸収に大きな違いがあることが多く、高いSNLスペクトルを得るためには、領域ごとに実験設定を変更する必要があります。VIS-SWIR生物学的スペクトルの取得が困難であるため、公開される生物学的吸収スペクトルが限られているため、このプロセスを簡素化することを目指しています。さらに、各生体成分の特定のスペクトル特性の理解を深めることで、強いメラニン吸収によって引き起こされる皮膚の色素沈着バイアスを最小限に抑えることができる最適化された波長を選択するのに役立ちます。

私たちのプロトコルにより、研究者が現在のVIS-SWIR生物学的吸収体ライブラリを拡大できるようになることを願っています。また、これらの結果は、メラニンが波長の関数として光学デバイスに与える影響を強調しており、SWIRのような皮膚の色素沈着バイアスが最小限に抑えられたシステムの設計に利用できる。全ヘパリン化ヒト血液で酸素化ヘモグロビンサンプルを調製するには、1.8ミリリットルの血液をマイクロ遠心チューブにピペットで入れます。

チューブを9.6gで10分間遠心分離し、ペレットを乱さずに約850マイクロリットルの上清を廃棄します。ペレットを約850マイクロリットルの重水素化水に再構成し、再び9.6gで10分間遠心分離します。最後の遠心分離の後、赤血球を溶解するために、赤血球ペレットを4.5ミリリットルの重水素化水で再構成します。

ペレットがチューブに付着している場合は、重水素化水の一部ですすいでほぐします。先端が鈍い針と注射器を使用して、溶解した血液溶液をチューブから取り出します。次に、鈍い先端の針をシリンジから取り外し、バイオハザードの鋭利な容器に捨てます。.

次に、0.22μmのシリンジフィルターをシリンジに取り付け、内容物を10mmの光路長、3.5mlのガラス、または石英キュベットにろ過します。キュベットを密閉ストッパーで固定し、汚染を防ぎます。ストッパーにパラフィルムを巻き付けて、完全に気密性の高いシールを確保します。

同じ経路、長さ、容量のきれいなキュベットに、ベースラインとリファレンス測定のために重水素化水を入れて、リファレンスを準備します。脱酸素化ヘモグロビンサンプルを調製するには、キュベット内の血液溶液にジチオナイトナトリウムを加えます。キュベットを気密ストッパーで固定し、パラフィルムをストッパーに巻き付けて気密シールを確保します。

ジチオン酸ナトリウムが完全に溶解するまで、キュベットを左右に慎重に傾けます。血液溶液の色が赤から濃い紫赤に変化するのを観察します。まず、分光計のランプと検出器をオンにし、システムを5〜20分間ウォームアップします。

キムワイプを使用してキュベットをエタノールで洗浄します。デュアルビーム分光器の場合は、重水素化水で満たされたキュベットを参照溶液としてサンプルチャンバーと参照チャンバーの両方に置きます。適切な波長範囲と、測定するスペクトル領域に基づいて検出器を選択します。

デフォルトのパラメーターを使用して参照測定値を取得します。次に、サンプルチャンバー内のキュベットを、酸素化ヘモグロビンが入ったキュベットと交換します。ライブモードに切り替えると、測定パラメータが調整される間、吸光度を連続的に表示できます。

デフォルトの分光計パラメータから始めて、データムあたりの読み取り値と帯域幅を調整して、飽和のない定性的にクリーンな吸収スペクトルを取得します。入射光のパワー、帯域幅、露光時間、およびデータムごとの読み取りを変更しても信号対雑音比のスペクトルが高くならない場合は、サンプル濃度を変更し、基準キュベットをサンプルまたは基準チャンバーに配置するか、サンプルと基準の光路長に配置して、高い信号対雑音比スペクトルを取得します。サンプルの設定を最適化したら、取得した各スペクトルの設定を文書化します。

最適化された設定を使用して、リファレンスチャンバーとサンプルチャンバー内のリファレンス溶液と同じ設定で再測定し、最適化されたリファレンス測定値を取得します。次に、サンプルチャンバー内のリファレンスキュベットを酸素化ヘモグロビンサンプルキュベットに交換し、最適なサンプル測定を行います。参照測定値とサンプル測定値の両方を別々に保存します。

次の式を使用して、参照測定値をI0、サンプル測定値をIとして扱い、吸光度Aを計算します。後処理では、MATLABなどのデータ解析ソフトウェアを開き、スペクトルの異なる領域から取得した吸光度測定値をロードします。1つのスペクトル領域に乗算係数を適用して、サンプル濃度や光路長が異なる異なる領域をつなぎ合わせます。酸素化されたヘモグロビンスペクトルは、Prahlによって公開されたスペクトルと強い相関を示し、可視領域では415ナノメートルで明確な吸収ピークと540〜575ナノメートルのダブレットがあり、近赤外線では800〜1,100ナノメートルの広範な吸収特徴があります。

短波赤外領域。酸素化されたヘモグロビンスペクトルは、おそらく残留水分含有量による低吸収を示しました。脱酸素化されたヘモグロビンスペクトルは、430ナノメートル、560ナノメートル、および760ナノメートルの顕著なピークと、1, 200ナノメートル、および1, 400から1, 600ナノメートルの間の小さなピークを特徴とする、プラールのスペクトルと強い相関を示しました。