グライコミクスガイド下グライコプロテオミクスは、複雑な腫瘍微小環境におけるグリコプロテオームの包括的なプロファイリングを容易にします

そこで、自然免疫系と免疫関連疾患における複雑な炭水化物(糖鎖)を研究し、現在は敗血症とがんに焦点を当てています。私たちの仕事には、ヒト糖タンパク質の詳細な特性評価のための、グライコミクス法やグライコプロテオミクス法などの分析方法とシステム糖鎖生物学が含まれます。グライコプロテオミクスは過去数十年で驚異的な進歩を遂げ、利用可能な高品質の質量分析データの不足によって進歩が制限されることはなくなりました。

むしろ、スペクトルデータから生物学的知識を解釈し、生成することが課題です。グライコミクスガイド下グライコプロテオミクス法により、糖鎖科学者はヒトの健康指標によるグリコプロテオームとハードバリアについて深く正確な洞察を得ることができ、グライコプロテオミクスは、グリコプロテオームに対するサイト特異的な洞察を生成することができる独自の能力を備えています。しかし、糖ペプチドの割合は依然として高いままです。

これらの再現性の問題に取り組むために、当社のグライコミクスグリコプロテオミクス法は、同じサンプルのグライコミクスサーベイを通じて糖鎖探索空間の制約を定義することにより、精密なグリコプロテオームプロファイリングを可能にします。最終的には、より迅速で正確な糖ペプチド検索が可能になります。当社のグライコミクスガイド下グライコプロテオミクス法は、さまざまなヒト検体からのグリコプロテオーム指標の不均一性とダイナミクスの包括的なマッピングを可能にします。

したがって、この方法は、疾患の進行をよりよく理解するのに役立ち、また、さまざまなヒト疾患に対する治療標的の新しい診断バイオマーカーを見つけるのにも役立ちます。グライコミクスガイド法によるグライコプロテオミクス法は、ヒトのグリコプロテオームの複雑さを解読することを可能にし、その結果、糖鎖構造がタンパク質機能、細胞コミュニケーション、免疫応答にどのように影響するかなど、新たな生物学的問題が明らかになります。また、特定の疾患でグリコシル化パターンがどのように、そしてなぜ変化したのかという疑問も提起しています。

そして、これらの洞察は、複雑な疾患における発見や新しい診断マーカー、個別化治療につながる可能性があります。目的のタンパク質をPVDFメンブレンに固定するには、シングルホールパンクチャーを使用して、スポットするサンプルの数に基づいてメンブレンを切断します。切除したメンブレムをメタノールで濡らし、平底の96ウェルプレートに移します。

メンブレンが乾きそうになったら、1スポットあたり2.5マイクロリットルのタンパク質サンプルを塗布します。メンブレンを摂氏20〜25度で少なくとも3時間、できれば一晩風乾し、汚染を避けるように注意します。100マイクロリットルの1%PDP-40をメタノール中で、斑点のあるメンブレンを含む各ウェルに加えます。

PDP-40溶液中でプレートを20〜25°Cで振とうします。5 分後、PDP-40 ソリューションを廃棄します。次に、ブロックされたタンパク質スポットを含む各ウェルを100マイクロリットルの超純水で洗浄し、プレートを5分間振とうします。

各ウェルに15マイクロリットルのPNGase F溶液を加えます。脱水症状を防ぐために、周囲の空の井戸に水を追加します。プレートを透明フィルムで慎重に密封し、摂氏37度で少なくとも8時間インキュベートします。

インキュベーション後、プレートを5分間超音波処理して、ウェルの側面にある蒸発した液滴が底に集まるのを助けます。遊離したN型糖鎖サンプルを個々の1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。各サンプルを20マイクロリットルの超純水で2回よく洗浄し、残りのすべてのサンプルを吸引して新しいチューブに結合します。

次に、100ミリモルの酢酸アンモニウムpH 5を10マイクロリットル加え、サンプルを摂氏20〜25度で1時間インキュベートします。N型糖鎖サンプルを真空濃縮装置で乾燥させます。自家製の多孔質グラファイトカーボン、PGC-C18固相抽出、またはSPEマイクロカラムを調製するには、シリンジを使用してC18ディスクを10マイクロリットルのピペットチップに差し込み、移し替えます。

50%メタノールに懸濁した10マイクロリットルのPGC樹脂スラリーをC18 SPEマイクロカラムにピペットで移します。マイクロカラムをマイクロ遠心アダプター付きの2ミリリットルチューブに入れます。チューブを回転させて、カラムの高さが約0.5cmのPGC-C18 SPEマイクロカラムを作成します。

次に、アセトニトリル中の 0.1% トリフルオロ酢酸 (TFA) 50 マイクロリットルをマイクロカラムに加え、2000 G で 60 秒間遠心分離して、移動相がマイクロカラムを通過するのを容易にします。同様に、0.1%水性TFAを使用してマイクロカラムを3回洗浄し、コンディショニングします。N型糖鎖サンプルを最大40マイクロリットルのローディング容量で各マイクロカラムに適用します。

各エディションの後にマイクロカラムを回転させ、サンプル全体がロードされるまで繰り返します。各マイクロカラムを20マイクロリットルの超純水で洗浄します。マイクロカラムを新しい1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移します。

N型糖鎖を溶出するには、50%アセトニトリル中の0.1%TFAを40マイクロリットルを各マイクロカラムに加えます。チューブを回転させ、各スピンからの溶出液を結合します。脱塩したN型糖鎖を真空濃縮装置システムで乾燥させます。

適切なソフトウェアを使用して、生成された LC-MS/MS 生データを閲覧します。狭い LC ピーク幅、N 型糖鎖異性体の効果的な分離、高い MS 精度、分離能、S/N 比、および高い CID MS/MS フラグメンテーション効率を評価することにより、高いデータ品質を確認します。モノアイソトピックプリカーサーの質量、CID MS/MSフラグメンテーションパターン、およびPGC-LCの相対保持時間および絶対保持時間に基づいて、サンプル中のN型糖鎖を手動で同定します。

相対 N 型糖鎖定量では、同定されたすべての N 型糖鎖異性体について、モノアイソトピックプリカーサーの質量電荷比を含むトランジションリストを作成します。すべての N 型糖鎖プリカーサーイオンの抽出イオンクロマトグラムから曲線下面積の値を決定します。ZIC-HILIC-C8-SPEマイクロカラムを調製するには、シリンジを使用して、C8ディスクを10マイクロリットルのピペットチップに差し込んで移し替えます。

メタノールに懸濁したZIC-HILIC樹脂のスラリーをC8-SPEマイクロカラムに沈着させます。マイクロカラムをマイクロ遠心アダプター付きの2ミリリットルチューブに入れ、カラムが中央に吊り下げられるようにします。スピンして、高さ約1cmのC8-SPE HPLCマイクロカラムを作製します。

50マイクロリットルのメタノールをマイクロカラムに加え、2000 Gで60秒間遠心分離し、移動相をカラムに通過させます。同様に、マイクロカラムを 3 回洗浄し、それぞれに 50 マイクロリットルの超純水を入れた後、50 マイクロリットルの 1%TFA 含有 80% アセトニトリルで洗浄します。N-糖ペプチド濃縮用に指定された乾燥ペプチド混合物を、80%アセトニトリル中の1%TFAの50マイクロリットルに再懸濁し、十分に混合します。

コンディションZIC-HILIC-C8-SPEマイクロカラムを、マイクロ遠心アダプター付きの新しい1.5ミリリットルチューブに入れます。再懸濁したペプチド混合物を各マイクロカラムに適用し、2000 Gで60秒間遠心します。フラクションを通るフローを収集し、各フラクションを同じZIC-HILIC-C8-SPEマイクロカラムに再適用します。

次に、50マイクロリットルの25ミリモル重炭酸アンモニウムと50マイクロリットルの50%アセトニトリルを順次添加してN-糖ペプチドを溶出します。マイクロカラムを新しい1.5ミリリットルの低結合マイクロ遠心チューブに移します。保持されたN-糖ペプチドを連続的に溶出させるには、50マイクロリットルの0.1%水性TFAをマイクロカラムに加え、2000 Gで60秒間遠心分離します。

次に、50マイクロリットルの0.1%水性TFAを順次添加し、続いて50マイクロリットルの25ミリモル重炭酸アンモニウムと50マイクロリットルの50%アセトニトリルを添加してN-糖ペプチドを溶出します。濃縮されたN-糖ペプチドと非修飾ペプチドを真空濃縮システム内のフラクションに流し、収集、結合、乾燥します。N-グリコミクスデータの解析により、結腸直腸癌組織中の76のN型糖鎖異性体が同定され、70%の複合糖鎖/ハイブリッド糖鎖、20%のオリゴマンノース、10%のパウシマンノースが同定されました。

すべての N 型糖鎖構造は、抽出されたイオンクロマトグラムの曲線下面積の値を使用して定量されたスペクトル証拠により確認されました。