Name: グライコミクスガイド下グライコプロテオミクスは、複雑な腫瘍微小環境におけるグリコプロテオームの包括的なプロファイリングを容易にします (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: 学ぶグライコミクスガイド下グライコプロテオミクス法で、質量分析データを用いて複雑な腫瘍微小環境におけるグリコプロテオームの包括的プロファイリングを行い、がん糖鎖生物学への深い洞察を得る方法です。

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<meta charset="utf8"></head><body>グライコミクスガイド下グライコプロテオミクスを用いた大腸がん組織のプロファイリング

タンパク質のグリコシル化は、生命の系統樹1,2,3の種によって産生されるタンパク質の共翻訳後修飾の一般的で複雑なタイプです。タンパク質結合型糖鎖は、細胞間相互作用やコミュニケーションイベントの媒介や調節など、ヒトの健康に重要な幅広い生物学的プロセスに影響を与えることが知られています4,5。タンパク質の糖鎖修飾の異常は、悪性形質転換、腫瘍の進行、および広がりの原因であると考えられています6,7,8。このことは、腫瘍微小環境(TME)における主要な腫瘍形成プロセスに糖鎖が関与していることを意味し、糖鎖ベースのバイオマーカーの発見や治療応用において、大きく未開拓の可能性を秘めています。したがって、糖鎖生物学は、癌研究および生命科学全体でますます注目を集めています9。
過去10 年、11、12、13、14、15、16、17 年にわたる糖分析とインフォマティクスの主要な開発により、液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析(LC-MS/MS)によるグライコミクスとグライコプロテオミクスは、糖鎖の複雑な混合物から遊離した糖鎖とインタクト糖ペプチドをシステム全体でプロファイリングするための強力なツールとして確立されています。さまざまな種類のがん患者標本(腫瘍組織、細胞集団、体液など)3,13,18,19,20などの生物学的サンプル起源から直接抽出された糖タンパク質。
グライコミクスは、細胞、組織、さらには生物全体によって動的に生成される糖鎖レパートリー(グライコン)の構造と量に関する情報を提供します。一方、グライコプロテオミクスは、タンパク質キャリアとそのグリコシル化部位、部位占有率(マクロ不均一性)、部位特異的な糖鎖組成とその部位分布パターン(ミクロ不均一性)に関する定量的情報を提供しますが、糖鎖構造情報は限られています(多くの場合、糖鎖組成に限定されます)15,16,21.したがって、グライコミクスとグライコプロテオミクスは、グリコプロテオームの生化学的詳細を調査するための補完的なアプローチです22。
グライコミクスおよびグライコプロテオミクスの無数の方法論的デザインと分析戦略が開発され、目的の糖鎖分析物(例:N-/O-/C結合、糖鎖/糖ペプチド/糖タンパク質、標識/非標識)、サンプルの性質(例:細胞、組織、体液)、量(ナノグラム/マイクログラム/ミリグラムのタンパク質レベル)、および利用可能な分析機器に応じて、ラボ間で適用されています23。24、25、26、27、28、29、30、31、32。グライコミクスとグライコプロテオミクスは、並行して使用することで得られる利点が認められているにもかかわらず、分析の専門知識や専門的な機器に対する需要が高いため、糖鎖生物学やがんの研究において単独で適用されることはなく、単独でのアプローチとして使用されています。
この技術ギャップを認識し、10年以上前に、グライコミクスと複雑な生体試料から得られたグライコプロテオミクスデータを統合できるグライコミクス支援グライコプロテオミクス法を導入しました33。要するに、グライコミクス支援(またはこのプロトコルのようにグライコミクスガイド)のグリコプロテオミクス技術は、確立された多孔質グラファイトカーボン(PGC)LC-MS/MS法34,35を通じてN型および/またはO型糖鎖をプロファイリングし、次いで、糖鎖探索空間36の境界を定義することにより、同じサンプルから取得したインタクトNおよび/またはO糖ペプチドデータの分析に使用される.PGC-LC-MS/MSは、高感度かつ構造分解能でグライコームを定量的に把握し、複雑な混合物内でも糖鎖のトポロジー(単糖配列と分岐パターン)とグリコシド結合に関する情報を得ることができるため、特に強力なグライコミクス法です35,37,38.グライコプロテオミクスのワークフローには、ペプチドの生成、オプションのペプチド標識、マルチプレックス、プリフラクショニング、および逆相 LC-MS/MS 分析前の濃縮が含まれます。これは、分析種の同定のためのステップコリジョンエネルギー/高エネルギー衝突解離(sceHCD、N-糖ペプチド用)や電子移動/高エネルギー衝突解離(EThcD、O-糖ペプチド用)など、さまざまなフラグメンテーション法を理想的に採用しています。N-グリコプロテオーム分析では、パラレルde-N-グリコプロテオミクスは、タンパク質/ペプチドの検索空間を定義し、占有されているN-グリコシル化部位とその占有率に関する詳細を提供することにより、インタクトN-グリコペプチドデータ解析を導くことができます。一方、非修飾ペプチドのパラレル分析では、研究条件間のタンパク質レベルの変化が明らかになります。
このホワイトペーパーでは、グライコミクスガイド下グライコプロテオミクス法の詳細でわかりやすいステップバイステップのプロトコールを提供します(ワークフローの概要については 図1 を参照)。このプロトコールは、サンプル調製ステップと LC-MS/MS ベースのグライコミクスおよびグライコプロテオミクス実験の実験詳細を提供し、大腸がん(CRC)患者から切除された腫瘍のホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織切片へのこのメソッドの適用を示す代表的な結果を提示し、世界中のがんバイオバンクにアーカイブされている貴重なサンプルタイプで TME の糖鎖生物学に関する洞察を可能にします。グライコミクスとグライコプロテオミクスデータの分析と統合についても簡単に説明します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67405/67405fig01v2.jpg"> 
図1:グライコミクスガイド下グライコプロテオミクス法の概要。 この概要は、グライコミクス(左)とグライコプロテオミクス(右)のワークフローにおける詳細な実験ステップを示しており、得られた情報の概要(太字)と、データ解析と解釈の改善を通じて2つのアプローチがどのように統合されているかを示しています。インサート:(i)グライコミクスおよび(ii-iii)グリコプロテオミクスのワークフローに使用される自家製SPEマイクロカラム。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67405/67405fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

<table><tbody><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>酢酸アンモニウム&nbsp;</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>A1542</td><td>代替品利用可能な</td></tr><tr><td>重炭酸アンモニウム、純度&ge;99.0%</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>A6141</td><td>代替品が利用可能</td></tr><tr><td>無水アセトニトリル(ACN)、LC-MSグレード</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>34851</td><td></td></tr>代替品 <tr><td>ウシフェチュイン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>F3004</td><td></td></tr>代替品 <tr><td>ジチオスレイトール(DTT)</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>D0632</td><td></td></tr>代替品 <tr><td>エタノール</td>シ<td>グマアルドリッチ</td><td>E7023</td><td>代替案あり</td></tr><tr><td>ギ酸、LC-MSグレード</td><td>Sigma Aldrich</td><td>00940</td><td>代替案あり</td></tr><tr><td>氷酢酸</td><td>ΣAldrich</td><td>A6283</td><td>代替案あり</td></tr><tr><td>ヨードアトアミド(IAA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I1149</td><td>代替案あり</td></tr><tr><td>メタノール</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1775</td><td>代替案あり</td></tr><tr><td>ペプチド-N-グリコシダーゼ F (PNGase F)</td><td>Promega</td><td>V4831</td><td>Elizabethkingia miricola PNGase F (10 U/&mu;L)大腸菌で組換えに発現する&nbsp;</td></tr><tr><td>ポリビニルピロリドン40(PVP)</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>PVP40</td><td>代替品が利用可能</td></tr><tr><td>水酸化カリウム(KOH)</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>484016</td><td>代替品が利用可能</td></tr><tr><td>シーケンシンググレードのブタトリプシン&nbsp;</td><td>Promega</td><td>V5113</td>の<td>代替品が利用可能</td></tr><tr><td>水素化ホウ素ナトリウム(NaBH4)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>213462</td><td>代替品が利用可能</td></tr><tr><td>重酸トリエチルアンモニウム(TEAB)、LC-MSグレードの</td><td>Sigma</td><td>Aldrich T7408</td>の<td>代替品</td></tr><tr><td>トリフルオロ酢酸(TFA)、LC-MSグレードの</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6508</td><td>の代替品が利用可能</td></tr><tr><td>ツール/材料</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C18ディスク</td><td>Empore</td><td>66883-U</td><td></td></tr><tr><td>C8ディスク</td><td>Empore</td><td>66882-U</td><td></td></tr><tr><td>平底ポリプロピレン96ウェルプレート&nbsp;</td><td>コーニング</td><td>3364</td><td></td></tr><tr><td>イモビロン-PSQポリフッ化ビニリデン(PVDF)メンブレン</td>ミリ<td>ポア</td><td>IPVH20200</td><td>細孔径:0.45&mu;m&nbsp;</td></tr><tr><td>微量遠心分離機</td><td>エッペンドルフ</td><td>5452000069</td><td>代替</td></tr><tr><td>利用可能な微量遠心アダプター&nbsp;</td><td>Nest Group, Inc., MA</td><td>SS18V</td><td>MiniSpin Column Collarには、Microspin</td></tr><tr><td>Columns Oligo R3樹脂</td><td>サーモ</td><td>1133903</td><td>粒径30 &mu;m</td></tr><tr><td>パラフィルム</td><td>パラフィルム M</td><td>PM996</td><td></td></tr><tr><td>プロテインローバインドチューブ 1.5 mL</td><td>エッペンドルフ</td><td>0030108450</td><td></td></tr><tr><td>プロテインロービンドチューブ 2.0 mL</td><td>エッペンドルフ</td><td>0030108442</td><td></td></tr><tr><td>セーフロックチューブ 1.5 mL</td><td>エッペンドルフ</td><td>0030120086</td><td></td></tr><tr><td>セーフロックチューブ 2.0 mL</td><td>エッペンドルフ</td><td>0030120094</td><td></td></tr><tr><td>シェーカー</td> エ<td>ッペンドルフ</td>利用可能な<td>5382000066</td><td>つの選択肢</td></tr><tr><td>シングルホールパンチャー</td><td>スイングライン</td><td>74005</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac コンセントレーター</td><td>マーティン・クライスト</td><td>RVC 2-25 CDplus</td><td>選択肢あり</td></tr><tr><td>Supelclean ENVI-Carb SPE樹脂</td><td>Supelco</td><td>57088</td><td>粒子サイズ 120-400 メッシュ。樹脂はカートリッジから手動で抽出でき、ミリQ水シリンジ5mLの50%(v/v)メタノールに長期保存することができます</td></tr><tr><td></td><td>シグマアルドリッチ</td><td>Z116866</td><td>代替品あり</td></tr><tr><td>温度制御インキュベーター</td><td>サーモライン</td><td>E7.30</td><td>代替品あり</td></tr><tr><td>超音波浴</td><td>ユニソニックス</td><td>FXP</td><td>代替品あり</td></tr><tr><td>ZIC-HILIC樹脂</td><td>メルク</td><td>150455</td><td>粒子/細孔サイズ、5 &mu;m / 200 &Aring;。樹脂はLCカラムから手動で抽出でき、MilliQ水</td></tr><tr><td>ZipTip C18固相抽出(SPE)マイクロカラム</td>中の50%(v / v)メタノールに長期間保存できます&nbsp;<td>ミリポア</td><td>ZTC18S096</td><td>あるいは、市販のC18-SPEマイクロカラム</td></tr>を市販の<tr><td>LC-MS/MS Analysis</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1260 Infinity Capillary HPLCシステム</td>に置き換えることもできます。<td>Agilent</td><td></td><td>の代替品が利用可能</td></tr><tr><td>ReproSil-Pur C18 AQ樹脂を充填した分析用LCカラム</td><td>Dr Maisch, Ammerbuch-Entringen, Germany</td><td>r13.aq.s2570</td><td>粒子/細孔サイズ: 3 &mu;m/120 (Aring;)、長さ/内径:25 cm/75 (m) 市販のC18 nano-LCカラムもご用意しています/&nbsp;</td></tr><tr><td>Dionex UltiMate 3000 RSLCnano LCシステム&nbsp;</td><td>利用可能なThermo Alternatives</td><td></td><td>:</td></tr><tr><td>HyperCarb KAPPA PGCキャピラリーLCカラム&nbsp;</td><td>Thermo</td><td>Discontinued</td><td>Particle/pore size, 3 &mu;m/250 &Aring;;カラムの長さ、30 mm;内径、0.180mm。HyperCarb PGC-LCカラムのより大きな形状で、同様の品質のデータが得られるものが市販されています(例:Thermo #35003-031030)。Merck の SupelTMCarb LC カラム、粒子/細孔サイズ、2.7 &mu;m/200 で、異なるカラム長と内径も利用可能です (例: Merck #59994-U)。</td></tr><tr><td>LCMSグレードのアセトニトリル</td><td>LiChrosolv</td><td>100029</td><td>代替品が利用可能</td></tr><tr><td>リニアトラップ四重極(LTQ)Velos Proイオントラップ質量分析計(グライコミクス)&nbsp;</td><td>Surveillance</td><td></td> Fusion<td></td></tr><tr><td>の代替品 Orbitrap Fusion Lumosトライブリッド質量分析計(グライコプロテオミクス)</td><td></td><td>ETDの有無にかかわらず、Thermo ETDの有無にかかわらず、他の高分解能MSシステム(O-グリコプロテオミクスにのみ必要)も利用可能です(例:Q-Exactive HF-X Hybrid Quadrupole-Orbitrap、Thermo、TIMS-ToF-MS、Bruker、または他のベンダーの同様の高性能質量分析計)</td>Total Recovery Clear Glass スクリューバイアル 0.9 mL <td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo</td><td>THC11093563</td><td>の代替品が利用可能</td></tr><tr><td>Total Recovery Clear Glass スクリューバイアル キャップに適合</td><td>Thermo</td><td>THC09150869</td><td>代替品が利用可能</td></tr><tr><td>ReproSil-Pur C18 AQ 樹脂を社内で充填した Trap LC カラム&nbsp;</td><td>Dr Maisch, Ammerbuch-Entringen, Germany</td><td>r15.aq.s0202</td><td>粒子/細孔サイズ: 5 &mu;m/120 (Aring;)、長さ/内径:2 cm/100 (m) 市販のC18トラップLCカラムもご用意しています。&nbsp;</td></tr><tr><td>ソフトウェア</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Byonic</td><td>Protein Metrics Inc</td><td>v2.6.46 以降</td><td>ほとんどの MS ベンダーから LC-MS/MS 生データを受け入れる商用糖ペプチドおよび PTM 検索エンジン、ほとんどの MS ベンダーから</td></tr><tr><td>Byos</td><td>Protein Metrics Inc</td><td>v3.9-7 以降</td><td>糖ペプチド候補の手動検査および糖鎖 MS/MS スペクトルの自動アノテーションのための商用ソフトウェア</td></tr><tr><td>GlycoMod</td><td>グライコミクスデータのアノテーションを支援する</td><td>Expasy</td><td></td> オープンアクセスソフトウェア (https://web.expasy.org/glycomod/)</tr><tr><td>GlycoWorkBench</td><td>EUROCarbDB</td><td>v2.1</td><td>グライコミクスデータのアノテーションと糖鎖漫画の描画を支援するオープンアクセスソフトウェア</td></tr><tr><td>RawMeat</td><td>VAST Scientific</td><td>v2.1</td><td>オープンアクセスソフトウェア、生スペクトルデータから糖鎖プリカーサーイオンのm/zを抽出</td></tr><tr><td>Skyline</td><td>Brendan X. MacLean</td><td>v21.2 以降</td><td>糖鎖の相対定量のためのオープンアクセスソフトウェア</td></tr><tr><td>Xcalibur</td><td>Thermo</td><td>v2.2 以上</td><td>生の LC-MS/MS データの閲覧用</td></tr></tbody></table>

グライコミクスガイド下グライコプロテオミクスは、複雑な腫瘍微小環境におけるグリコプロテオームの包括的なプロファイリングを容易にします 

Glycomics-Guided Glycoproteomics Facilitates Comprehensive Profiling of the Glycoproteome in Complex Tumor Microenvironments

このセクションでは、ステージIIのCRCに罹患している患者のFFPE組織スライドに適用されたグライコミクスガイド下グライコプロテオミクス法の代表的な結果を示します。
プロトコールに十分なタンパク質出発物質を達成するために、2つのスライド(zスタック)からのタンパク質抽出物を、公開されたプロトコールに従って同じFFPE組織ブロックから組み合わせ、TMT標識アプローチを適用してグライコプロテオミクス実験の感度を向上させた(以下のオプションのステップを参照)42。
まず、PGC-LC-MS/MS ベースの N-グリコミクスによる FFPE CRC 組織のデータ解析により、59 の糖鎖組成にまたがる合計 76 の N 型糖鎖異性体が同定されました(図 2)。CRC組織43の以前のN-グリコームプロファイリング研究と同様に、複合体/ハイブリッドN型糖鎖が最も多く存在するタイプ(~70...

Glycosylation is a common and structurally diverse protein modification that impacts a wide range of tumorigenic processes. Mass spectrometry-driven ...

そこで、自然免疫系と免疫関連疾患における複雑な炭水化物(糖鎖)を研究し、現在は敗血症とがんに焦点を当てています。私たちの仕事には、ヒト糖タンパク質の詳細な特性評価のための、グライコミクス法やグライコプロテオミクス法などの分析方法とシステム糖鎖生物学が含まれます。グライコプロテオミクスは過去数十年で驚異的な進歩を遂げ、利用可能な高品質の質量分析データの不足によって進歩が制限されることはなくなりました。むしろ、スペクトルデータから生物学的知識を解釈し、生成することが課題です。グライコミクスガイド下グライコプロテオミクス法により、糖鎖科学者はヒトの健康指標によるグリコプロテオームとハードバリアについて深く正確な洞察を得ることができ、グライコプロテオミクスは、グリコプロテオームに対するサイト特異的な洞察を生成することができる独自の能力を備えています。しかし、糖ペプチドの割合は依然として高いままです。これらの再現性の問題に取り組むために、当社のグライコミクスグリコプロテオミクス法は、同じサンプルのグライコミクスサーベイを通じて糖鎖探索空間の制約を定義することにより、精密なグリコプロテオームプロファイリングを可能にします。最終的には、より迅速で正確な糖ペプチド検索が可能になります。当社のグライコミクスガイド下グライコプロテオミクス法は、さまざまなヒト検体からのグリコプロテオーム指標の不均一性とダイナミクスの包括的なマッピングを可能にします。したがって、この方法は、疾患の進行をよりよく理解するのに役立ち、また、さまざまなヒト疾患に対する治療標的の新しい診断バイオマーカーを見つけるのにも役立ちます。グライコミクスガイド法によるグライコプロテオミクス法は、ヒトのグリコプロテオームの複雑さを解読することを可能にし、その結果、糖鎖構造がタンパク質機能、細胞コミュニケーション、免疫応答にどのように影響するかなど、新たな生物学的問題が明らかになります。また、特定の疾患でグリコシル化パターンがどのように、そしてなぜ変化したのかという疑問も提起しています。そして、これらの洞察は、複雑な疾患における発見や新しい診断マーカー、個別化治療につながる可能性があります。目的のタンパク質をPVDFメンブレンに固定するには、シングルホールパンクチャーを使用して、スポットするサンプルの数に基づいてメンブレンを切断します。切除したメンブレムをメタノールで濡らし、平底の96ウェルプレートに移します。メンブレンが乾きそうになったら、1スポットあたり2.5マイクロリットルのタンパク質サンプルを塗布します。メンブレンを摂氏20〜25度で少なくとも3時間、できれば一晩風乾し、汚染を避けるように注意します。100マイクロリットルの1%PDP-40をメタノール中で、斑点のあるメンブレンを含む各ウェルに加えます。PDP-40溶液中でプレートを20〜25°Cで振とうします。5 分後、PDP-40 ソリューションを廃棄します。次に、ブロックされたタンパク質スポットを含む各ウェルを100マイクロリットルの超純水で洗浄し、プレートを5分間振とうします。各ウェルに15マイクロリットルのPNGase F溶液を加えます。脱水症状を防ぐために、周囲の空の井戸に水を追加します。プレートを透明フィルムで慎重に密封し、摂氏37度で少なくとも8時間インキュベートします。インキュベーション後、プレートを5分間超音波処理して、ウェルの側面にある蒸発した液滴が底に集まるのを助けます。遊離したN型糖鎖サンプルを個々の1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。各サンプルを20マイクロリットルの超純水で2回よく洗浄し、残りのすべてのサンプルを吸引して新しいチューブに結合します。次に、100ミリモルの酢酸アンモニウムpH 5を10マイクロリットル加え、サンプルを摂氏20〜25度で1時間インキュベートします。N型糖鎖サンプルを真空濃縮装置で乾燥させます。自家製の多孔質グラファイトカーボン、PGC-C18固相抽出、またはSPEマイクロカラムを調製するには、シリンジを使用してC18ディスクを10マイクロリットルのピペットチップに差し込み、移し替えます。50%メタノールに懸濁した10マイクロリットルのPGC樹脂スラリーをC18 SPEマイクロカラムにピペットで移します。マイクロカラムをマイクロ遠心アダプター付きの2ミリリットルチューブに入れます。チューブを回転させて、カラムの高さが約0.5cmのPGC-C18 SPEマイクロカラムを作成します。次に、アセトニトリル中の 0.1% トリフルオロ酢酸 (TFA) 50 マイクロリットルをマイクロカラムに加え、2000 G で 60 秒間遠心分離して、移動相がマイクロカラムを通過するのを容易にします。同様に、0.1%水性TFAを使用してマイクロカラムを3回洗浄し、コンディショニングします。N型糖鎖サンプルを最大40マイクロリットルのローディング容量で各マイクロカラムに適用します。各エディションの後にマイクロカラムを回転させ、サンプル全体がロードされるまで繰り返します。各マイクロカラムを20マイクロリットルの超純水で洗浄します。マイクロカラムを新しい1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移します。N型糖鎖を溶出するには、50%アセトニトリル中の0.1%TFAを40マイクロリットルを各マイクロカラムに加えます。チューブを回転させ、各スピンからの溶出液を結合します。脱塩したN型糖鎖を真空濃縮装置システムで乾燥させます。適切なソフトウェアを使用して、生成された LC-MS/MS 生データを閲覧します。狭い LC ピーク幅、N 型糖鎖異性体の効果的な分離、高い MS 精度、分離能、S/N 比、および高い CID MS/MS フラグメンテーション効率を評価することにより、高いデータ品質を確認します。モノアイソトピックプリカーサーの質量、CID MS/MSフラグメンテーションパターン、およびPGC-LCの相対保持時間および絶対保持時間に基づいて、サンプル中のN型糖鎖を手動で同定します。相対 N 型糖鎖定量では、同定されたすべての N 型糖鎖異性体について、モノアイソトピックプリカーサーの質量電荷比を含むトランジションリストを作成します。すべての N 型糖鎖プリカーサーイオンの抽出イオンクロマトグラムから曲線下面積の値を決定します。ZIC-HILIC-C8-SPEマイクロカラムを調製するには、シリンジを使用して、C8ディスクを10マイクロリットルのピペットチップに差し込んで移し替えます。メタノールに懸濁したZIC-HILIC樹脂のスラリーをC8-SPEマイクロカラムに沈着させます。マイクロカラムをマイクロ遠心アダプター付きの2ミリリットルチューブに入れ、カラムが中央に吊り下げられるようにします。スピンして、高さ約1cmのC8-SPE HPLCマイクロカラムを作製します。50マイクロリットルのメタノールをマイクロカラムに加え、2000 Gで60秒間遠心分離し、移動相をカラムに通過させます。同様に、マイクロカラムを 3 回洗浄し、それぞれに 50 マイクロリットルの超純水を入れた後、50 マイクロリットルの 1%TFA 含有 80% アセトニトリルで洗浄します。N-糖ペプチド濃縮用に指定された乾燥ペプチド混合物を、80%アセトニトリル中の1%TFAの50マイクロリットルに再懸濁し、十分に混合します。コンディションZIC-HILIC-C8-SPEマイクロカラムを、マイクロ遠心アダプター付きの新しい1.5ミリリットルチューブに入れます。再懸濁したペプチド混合物を各マイクロカラムに適用し、2000 Gで60秒間遠心します。フラクションを通るフローを収集し、各フラクションを同じZIC-HILIC-C8-SPEマイクロカラムに再適用します。次に、50マイクロリットルの25ミリモル重炭酸アンモニウムと50マイクロリットルの50%アセトニトリルを順次添加してN-糖ペプチドを溶出します。マイクロカラムを新しい1.5ミリリットルの低結合マイクロ遠心チューブに移します。保持されたN-糖ペプチドを連続的に溶出させるには、50マイクロリットルの0.1%水性TFAをマイクロカラムに加え、2000 Gで60秒間遠心分離します。次に、50マイクロリットルの0.1%水性TFAを順次添加し、続いて50マイクロリットルの25ミリモル重炭酸アンモニウムと50マイクロリットルの50%アセトニトリルを添加してN-糖ペプチドを溶出します。濃縮されたN-糖ペプチドと非修飾ペプチドを真空濃縮システム内のフラクションに流し、収集、結合、乾燥します。N-グリコミクスデータの解析により、結腸直腸癌組織中の76のN型糖鎖異性体が同定され、70%の複合糖鎖/ハイブリッド糖鎖、20%のオリゴマンノース、10%のパウシマンノースが同定されました。すべての N 型糖鎖構造は、抽出されたイオンクロマトグラムの曲線下面積の値を使用して定量されたスペクトル証拠により確認されました。

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

本研究では、特定のタンパク質のグリコシル化プロファイリングに使用することができるレクチン検出法による多重化、ハイスループット抗体マイクロアレイのための改良プロトコルを記述します。このプロトコルは、新しい信頼性の高い試薬を備えており、前の手順に比べて大幅に時間、コスト、およびラボ機器の要件を軽減します。...

複雑なサンプル中の特定のタンパク質のグリコシル化の多重化ハイスループットプロファイリングのための化学的にブロックされた抗体マイクロアレイ

マイクロアレイを用いた植物細胞壁ポリマーの糖鎖プロファイリング

細胞表面タンパク質は、生物学的に重要かつ広範にグリコシル化されている。我々は、可溶化豊かに、そして容易なLC-MSベースのプロテオミクス解析のための脱グリコシル化は、これらのタンパク質には、ここグリコペプチド捕捉アプローチをご紹介します。...

細胞表面プロテオミクスのための糖ペプチドキャプチャ

癌細胞プロテオームの詳細な分析は、新規の薬物標的と診断バイオマーカーの同定を容易にします。ここでは、液体および固体腫瘍に由来するがん細胞亜集団における(リン酸化)プロテオームの定量解析のための実験ワークフローについて説明します。これは、細胞濃縮戦略と定量的なSuper-SILACベースの質量分析を組み合わせることで達成されます。...

液体および固形腫瘍由来の癌細胞のプロテオームの定量的質量分析プロファイリング

この記事は、GC-MSによる検出のために、糖鎖をそれらの構成結合特異的単糖類に化学的に分解することにより、未分画生体流体中の糖鎖のプール組成プロファイルを分析するように設計された新しいボトムアップグライコミクス技術の強化形を提示します。潜在的なアプリケーションには、がんやその他の糖鎖影響性疾患の早期発見が含まれます。...

糖鎖ノード分析：グライコミクスへのボトムアップアプローチ

本稿では、ECMタンパク質組成物の（1）分析、グリコシル化部位の（2）識別、およびグリカン形態の（3）組成の特徴付けを可能にするMS分析のために心臓血管組織サンプルを調製する方法を記載しています。この方法は、他の組織におけるECMの研究に、軽微な修正を適用することができます。...

細胞外マトリックスのグライコ：質量分析法を用いて無傷の糖ペプチドの分析のための方法

シアログリカンマイクロアレイアッセイを用いてヒト血清中の抗Neu5Gc抗体を評価し、癌および他の慢性炎症媒介ヒト疾患のハイスループット診断アッセイを可能にする。...

Sialoglycanマイクロアレイアッセイによるヒト血清中の抗Neu5Gc IgGのプロファイリング

このプロトコルは、オンラインリソースでヒトタンパク質グリカムを探索、比較、および解釈する方法を示しています。...

グリカン媒介タンパク質相互作用の研究のためのバイオインフォマティクスリソース

このプロトコルは、ホルマリン固定パラフィン包埋組織切片におけるタンパク質イメージングマスサイトメトリーによるマルチプレックスmRNA検出の方法論を詳述しています。...

デュアルモダリティ分子地図作成:マルチプレックスmRNA検出とタンパク質イメージングマスサイトメトリーの統合

このプロトコルは、レーザーキャプチャーマイクロディセプションを用いて、腫瘍血管新生の定量的プロテオミクス解析のために、グリオーマサンプルから高品質な新生血管組織を十分に調製することに成功し、従来の主に血管新生因子に焦点を当てた研究の限界を克服し、グリオーマ血管新生の大規模なプロテオミクスプロファイルを提供しました。...

腫瘍血管新生の定量的プロテオミクス解析のためのヒト膠質腫組織からの新生血管組織の調製

学ぶグライコミクスガイド下グライコプロテオミクス法で、質量分析データを用いて複雑な腫瘍微小環境におけるグリコプロテオームの包括的プロファイリングを行い、がん糖鎖生物学への深い洞察を得る方法です。

グライコミクスガイド下グライコプロテオミクスは、複雑な腫瘍微小環境におけるグリコプロテオームの包括的なプロファイリングを容易にします

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