Name: 繊毛形成の細胞モデルにおけるソニックヘッジホッグシグナル伝達を測定するための定量的PCRベースアッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: 学ぶソニックヘッジホッグシグナル伝達の定量PCRベースアッセイ。RPE-1細胞を用いて一次繊毛機能を評価し、遺伝学的変化を検出する高感度な細胞培養法です。神経科学と細胞生物学研究に有用です。

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<ol><li>Nigg, E. A., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrioles%2C+centrosomes%2C+and+cilia+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Centrioles, centrosomes, and cilia in health and disease.</a> Cell. 139 (4), 663-678 (2009).</li>
<li>Halder, P., Khatun, S., Majumder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Freeing+the+brake%3A+Proliferation+needs+primary+cilium+to+disassemble%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biosci%22%5BJournal%5D)">Freeing the brake: Proliferation needs primary cilium to disassemble.</a> J Biosci. 45, 117(2020).</li>
<li>Eguether, T., Cordelieres, F. P., Pazour, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraflagellar+transport+is+deeply+integrated+in+hedgehog+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Intraflagellar transport is deeply integrated in hedgehog signaling.</a> Mol Biol Cell. 29 (10), 1178-1189 (2018).</li>
<li>Ishikawa, H., Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraflagellar+transport+and+ciliary+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Intraflagellar transport and ciliary dynamics.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 9 (3), a021998(2017).</li>
<li>Hildebrandt, F., Benzing, T., Katsanis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliopathies%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Ciliopathies.</a> N Engl J Med. 364 (16), 1533-1543 (2011).</li>
<li>Reiter, J. F., Leroux, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+and+molecular+pathways+underpinning+ciliopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Genes and molecular pathways underpinning ciliopathies.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (9), 533-547 (2017).</li>
<li>Hilgendorf, K. I., Myers, B. R., Reiter, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+mechanistic+understanding+of+cilia+function+in+cellular+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Emerging mechanistic understanding of cilia function in cellular signalling.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 25 (7), 555-573 (2024).</li>
<li>Bansal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+pathway+activation+alters+ciliary+signaling+in+primary+hypothalamic+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Hedgehog pathway activation alters ciliary signaling in primary hypothalamic cultures.</a> Front Cell Neurosci. 13, 266(2019).</li>
<li>Gigante, E. D., Caspary, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+in+the+primary+cilium+through+the+lens+of+the+hedgehog+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Signaling in the primary cilium through the lens of the hedgehog pathway.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 9 (6), e377(2020).</li>
<li>Anvarian, Z., Mykytyn, K., Mukhopadhyay, S., Pedersen, L. B., Christensen, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+signalling+by+primary+cilia+in+development%2C+organ+function+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Cellular signalling by primary cilia in development, organ function and disease.</a> Nat Rev Nephrol. 15 (4), 199-219 (2019).</li>
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<li>Brown, J. M., Witman, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cilia+and+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience%22%5BJournal%5D)">Cilia and diseases.</a> Bioscience. 64 (12), 1126-1137 (2014).</li>
<li>Hanaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alstrom+syndrome%3A+A+review+focusing+on+its+diverse+clinical+manifestations+and+their+etiology+as+a+ciliopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Yonago+Acta+Med%22%5BJournal%5D)">Alstrom syndrome: A review focusing on its diverse clinical manifestations and their etiology as a ciliopathy.</a> Yonago Acta Med. 67 (2), 93-99 (2024).</li>
<li>Merrill, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliary+abnormalities+due+to+defects+in+the+retrograde+transport+protein+dync2h1+in+short-rib+polydactyly+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Ciliary abnormalities due to defects in the retrograde transport protein dync2h1 in short-rib polydactyly syndrome.</a> Am J Hum Genet. 84 (4), 542-549 (2009).</li>
<li>Dagoneau, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dync2h1+mutations+cause+asphyxiating+thoracic+dystrophy+and+short+rib-polydactyly+syndrome%2C+type+iii%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Dync2h1 mutations cause asphyxiating thoracic dystrophy and short rib-polydactyly syndrome, type iii.</a> Am J Hum Genet. 84 (5), 706-711 (2009).</li>
<li>Majumder, S., Fisk, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vdac3+and+mps1+negatively+regulate+ciliogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Vdac3 and mps1 negatively regulate ciliogenesis.</a> Cell Cycle. 12 (5), 849-858 (2013).</li>
<li>Briscoe, J., Therond, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanisms+of+hedgehog+signalling+and+its+roles+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The mechanisms of hedgehog signalling and its roles in development and disease.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (7), 416-429 (2013).</li>
<li>Placzek, M., Briscoe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonic+hedgehog+in+vertebrate+neural+tube+development%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Sonic hedgehog in vertebrate neural tube development.</a> Int J Dev Biol. 62 (1-2-3), 225-234 (2018).</li>
<li>Wong, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cilia+can+both+mediate+and+suppress+hedgehog+pathway-dependent+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Primary cilia can both mediate and suppress hedgehog pathway-dependent tumorigenesis.</a> Nat Med. 15 (9), 1055-1061 (2009).</li>
<li>Deshpande, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smoothened+stimulation+by+membrane+sterols+drives+hedgehog+pathway+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Smoothened stimulation by membrane sterols drives hedgehog pathway activity.</a> Nature. 571 (7764), 284-288 (2019).</li>
<li>Mukhopadhyay, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ciliary+g-protein-coupled+receptor+gpr161+negatively+regulates+the+sonic+hedgehog+pathway+via+camp+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The ciliary g-protein-coupled receptor gpr161 negatively regulates the sonic hedgehog pathway via camp signaling.</a> Cell. 152 (1-2), 210-223 (2013).</li>
<li>Niewiadomski, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gli+protein+activity+is+controlled+by+multisite+phosphorylation+in+vertebrate+hedgehog+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Gli protein activity is controlled by multisite phosphorylation in vertebrate hedgehog signaling.</a> Cell Rep. 6 (1), 168-181 (2014).</li>
<li>Kovacs, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-arrestin-mediated+localization+of+smoothened+to+the+primary+cilium%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Beta-arrestin-mediated localization of smoothened to the primary cilium.</a> Science. 320 (5884), 1777-1781 (2008).</li>
<li>He, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinesin-4+protein+kif7+regulates+mammalian+hedgehog+signalling+by+organizing+the+cilium+tip+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The kinesin-4 protein kif7 regulates mammalian hedgehog signalling by organizing the cilium tip compartment.</a> Nat Cell Biol. 16 (7), 663-672 (2014).</li>
<li>Wen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+hedgehog-dependent+full-length+gli3+accumulation+in+primary+cilia+and+subsequent+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Kinetics of hedgehog-dependent full-length gli3 accumulation in primary cilia and subsequent degradation.</a> Mol Cell Biol. 30 (8), 1910-1922 (2010).</li>
<li>Griffiths, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog-interacting+protein+is+a+multimodal+antagonist+of+hedgehog+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Hedgehog-interacting protein is a multimodal antagonist of hedgehog signalling.</a> Nat Commun. 12 (1), 7171(2021).</li>
<li>Gomez, A. E., Christman, A. K., Van De Weghe, J. C., Finn, M., Doherty, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+analysis+of+cilia+characteristics+and+hedgehog+signaling+in+five+immortal+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Systematic analysis of cilia characteristics and hedgehog signaling in five immortal cell lines.</a> PLoS One. 17 (12), e0266433(2022).</li>
<li>Schmidt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cilia+and+shh+signaling+impairments+in+human+and+mouse+models+of+parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Primary cilia and shh signaling impairments in human and mouse models of parkinson's disease.</a> Nat Commun. 13 (1), 4819(2022).</li>
<li>Dutta, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increase+in+primary+cilia+number+and+length+upon+vdac1+depletion+contributes+to+attenuated+proliferation+of+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Increase in primary cilia number and length upon vdac1 depletion contributes to attenuated proliferation of cancer cells.</a> Exp Cell Res. 429 (2), 113671(2023).</li>
<li>De, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperphosphorylation+of+cdh1+in+glioblastoma+cancer+stem+cells+attenuates+apc%2Fc%28cdh1%29+activity+and+pharmacologic+inhibition+of+apc%2Fc%28cdh1%2Fcdc20%29+compromises+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Hyperphosphorylation of cdh1 in glioblastoma cancer stem cells attenuates apc/c(cdh1) activity and pharmacologic inhibition of apc/c(cdh1/cdc20) compromises viability.</a> Mol Cancer Res. 17 (7), 1519-1530 (2019).</li>
<li>Yang, S., Zheng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunofluorescence-based+detection+of+hedgehog+pathway+components+in+primary+cilia+of+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The immunofluorescence-based detection of hedgehog pathway components in primary cilia of cultured cells.</a> Methods Mol Biol. 2374, 89-94 (2022).</li>
<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mir-669a-5p%2Fg3bp%2Fhdac6%2Fakap12+axis+regulates+primary+cilia+length%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Sci+%28Weinh%29%22%5BJournal%5D)">The mir-669a-5p/g3bp/hdac6/akap12 axis regulates primary cilia length.</a> Adv Sci (Weinh). 11 (6), e2305068(2024).</li>
<li>Alanazi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+the+roles+of+mir-17+in+ciliogenesis+and+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Identifying the roles of mir-17 in ciliogenesis and cell cycle.</a> Front Cell Dev Biol. 12, 1397931(2024).</li>
<li>Bustin, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+miqe+guidelines%3A+Minimum+information+for+publication+of+quantitative+real-time+pcr+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">The miqe guidelines: Minimum information for publication of quantitative real-time pcr experiments.</a> Clin Chem. 55 (4), 611-622 (2009).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>DMSO、滅菌フィルター</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>ロバ、抗マウス IgG (H+L) Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A21202</td><td></td></tr><tr><td>ロバ、抗ウサギ IgG (H+L) Alexa Fluor 568</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A10042</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco、ThermoFisher Scientific</td><td>41965039</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)</td><td>Gibco、ThermoFisher Scientific</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine serum (FBS)</td><td>Himedia</td><td>RM1112</td><td></td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡、60倍対物</td>レンズCarl <td>Zeiss&nbsp;</td><td></td><td>Axio observer colibri 5</td></tr><tr><td>hTERT-RPE1 cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-4000</td><td></td></tr><tr><td>iScript cDNA Synthesis Kit</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1708891</td><td></td></tr><tr><td>Mouse, monoclonal anti-acetylated tubulin antibody</td><td>Milipore Sigma-Aldrich</td><td>T7451</td><td>最終希釈 1:1000</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin, 100X</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>定量 PCR マシン、CFX 96</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rabbit、ポリクローナル Arl13B 抗体</td><td>ProteinTech</td><td>17711-1-AP</td><td>最終希釈 1:250</td></tr><tr><td>ウサギ、ポリクローナル Cep135 抗体</td><td>ProteinTech</td><td>24428-1-AP</td><td>最終希釈 1:500</td></tr><tr><td>SlowFade gold 退色防止剤</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S36940</td><td></td></tr><tr><td>スムスナイズアゴニスト(SAG)&nbsp;</td><td>Abmole</td><td>M4865</td><td>ストック溶液: DMSO、5 mM</td></tr><tr><td>SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1725271</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reagent</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Gibco、ThermoFisher Scientific</td><td>12605028</td><td></td></tr></tbody></table>

繊毛形成の細胞モデルにおけるソニックヘッジホッグシグナル伝達を測定するための定量的pcrベースアッセイ

Quantitative PCR-based Assay to Measure Sonic Hedgehog Signaling in Cellular Model of Ciliogenesis

PCを介したSHHシグナル伝達経路の活性化は、PC7の適切な機能を理解する方法です。ここでは、主に繊毛のあるRPE1細胞におけるSHH経路のSAG媒介活性化時に、RT-qPCRアッセイを用いてSHH経路標的遺伝子の相対発現を測定します。SHH経路の直接的な転写出力であるGLI1およびPTCH1は、この経路11の活性を測定するために頻繁に使用されます。このプロトコルには、SHH経路によって調節されているHHIP転写産物も含まれています。SMOはSHH経路の直接の標的ではないため、SMOの転写レベルはSHH経路の活性化によって変化することはなく、したがってコントロールとして使用されます。β-ACTINは、血清飢餓状態のRPE1細胞におけるSAG刺激によってそのレベルが変化しないため、正常化に使用されました(データは示されていません)。
この場合、RPE1細胞を繊毛形成の誘導のために血清飢餓培地で48時間インキュベートした。最後の 24 時間の間に、細胞を SAG またはコントロール溶媒 DM...

繊毛形成の細胞モデルにおけるソニックヘッジホッグシグナル伝達を測定するための定量的PCRベースアッセイ

Ciliopathy refers to a collection of multisystemic and polygenic human diseases and disorders that arise due to aberration of structure or function of ...

quantitative-pcr-based-assay-to-measure-sonic-hedgehog-signaling

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

心原性誘導効率を定量化するために修飾されたマウス胚性幹細胞ベースのアッセイ

ゲインまたは機能喪失を媒介するためにレンチウイルスを用いて、毛包の再生モデルの組織特異的分析。...

髪の再生の間に上皮間葉シグナル伝達の迅速遺伝子解析

ここで原稿がアフリカツメガエルにおける蛍光タグ付きリガンドの分泌と普及を分析するための方法の簡単なセットを提供します。これは、リガンドの分布を変更するための他のタンパク質の能力を試験し、モルフォゲン勾配を調節するメカニズムへの洞察を与えることが実験を可能にするためのコンテキストを提供します。...

の共焦点分析を用いました<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt; WntおよびShhのモルフォゲン勾配の調節を調査するために、

一次繊毛は、さまざまなシグナル伝達経路に影響を与えます。哺乳類の蝸牛は、平面細胞極性(PCP)シグナル伝達を調べるのに理想的です。繊毛の機能障害は、蝸牛の成長、細胞パターン化、有毛細胞の配向、PCPの読み取りに影響を与えます。私たちの目標は、表現型解析、免疫組織化学、走査型電子顕微鏡法を通じて、マウス蝸牛のPCPシグナル伝達を分析することです。...

繊毛病マウス変異蝸牛における平面セル・-極性表現型の評価

このビデオの記事では、体系的かつ効率的に多くの無脊椎動物の胚では、複雑なシグナル伝達経路および制御ネットワークの構成要素を特徴付けるために使用することができるin vivoでの方法論に簡単な詳細を示します。...

シンプルの力：ウニ胚として<em&gt; in vivoで</em&gt;複雑な細胞間シグナル伝達ネットワークの相互作用を研究するための発達モデル

我々 は正常に 2 つの基質特異的 γ-セクレターゼ アッセイを生成されます。ここに提示両方のセルベースのアッセイは、ホタル ルシフェラーゼ レポーターのアウトプットを介して γ...

Γ セクレターゼによるアミロイド前駆体タンパク質と細胞を用いたルシフェラーゼ レポーター アッセイ プラットフォーム ノッチ胸の谷間の定量的測定

マイクロ流体チップ上のマウス胚組織の培養および操作のためのプロトコールが提供される。経路変調器のパルスを印加することにより、このシステムは、マウスのソミトジェネシスの機能的調査のためのシグナル伝達振動を外部的に制御するために使用することができる。...

ソミトジェネシスを支配するシグナル伝達振動の機能的調査のためのマイクロフルイディクスアプローチ

我々は、新皮質発生の2Dおよび3Dヒト人工多能性幹細胞(hIPSC)ベースのモデルの生成および特性評価のための詳細なプロトコル、ならびに初代繊毛(PC)生合成および機能の定性的および定量的分析を可能にする補完的方法論を提示する。...

2Dおよび3Dヒト人工多能性幹細胞ベースのモデルにより、新皮質発生中の原発性繊毛の関与を解剖

ここでは、費用対効果が高く、効率的で実行可能な一次小脳顆粒細胞前駆体(GCP)の遺伝子操作のための再現性のある インビトロ...

顆粒細胞前駆体における原発性シリウム依存シグナル伝達経路を研究するための効率的で費用対効果の高いエレクトロポレーション法

テングザルの拡張レスポンスやPERはハエだけでなくミツバチで使用されている味の行動アッセイである。口吻が魅力的な物質と接触するときに、ハエは物質を消費するため、その口吻を拡張します。様々な糖のソリューションは、その場に非常に魅力的です。...

ショウジョウバエにおけるテングザル拡張レスポンス（PER）アッセイ

学ぶソニックヘッジホッグシグナル伝達の定量PCRベースアッセイ。RPE-1細胞を用いて一次繊毛機能を評価し、遺伝学的変化を検出する高感度な細胞培養法です。神経科学と細胞生物学研究に有用です。

繊毛形成の細胞モデルにおけるソニックヘッジホッグシグナル伝達を測定するための定量的PCRベースアッセイ

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