Name: カルシウムイオンチャネルの活性化を研究するためのシングルセルカルシウムイメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-13T14:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: 学ぶシングルセルカルシウムイメージング法でFura-2/AMを用いて細胞内カルシウム濃度をリアルタイムに定量測定します。TRPV1チャネル活性化メカニズムや温度・痛覚受容体の研究に応用できます。

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<meta charset="utf8"></head><body>チャネル活性化研究のためのシングルセルカルシウムイメージング

<ol><li>Murthy, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+for+contraction+and+relaxation+in+smooth+muscle+of+the+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Signaling for contraction and relaxation in smooth muscle of the gut.</a> Annu Rev Physiol. 68, 345-374 (2006).</li>
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<li>Behera, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyses+of+Ca2%2B+dynamics+using+a+ubiquitin-10+promoter-driven+yellow+cameleon+3.6+indicator+reveal+reliable+transgene+expression+and+differences+in+cytoplasmic+Ca2%2B+responses+in+arabidopsis+and+rice+%28oryza+sativa%29+roots%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">Analyses of Ca2+ dynamics using a ubiquitin-10 promoter-driven yellow cameleon 3.6 indicator reveal reliable transgene expression and differences in cytoplasmic Ca2+ responses in arabidopsis and rice (oryza sativa) roots.</a> New Phytol. 206 (2), 751-760 (2015).</li>
<li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+signal-to-noise+ca%282%2B%29+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A high signal-to-noise ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nat Biotechnol. 19 (2), 137-141 (2001).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+analysis+of+stim1+thermal+sensation%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism analysis of stim1 thermal sensation.</a> Cells. 12 (22), 2613(2023).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATF6+safeguards+organelle+homeostasis+and+cellular+aging+in+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Discov%22%5BJournal%5D)">ATF6 safeguards organelle homeostasis and cellular aging in human mesenchymal stem cells.</a> Cell Discov. 4, 2(2018).</li>
<li>Jiang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanosensitive+piezo1+channel+mediates+heart+mechano-chemo+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">The mechanosensitive piezo1 channel mediates heart mechano-chemo transduction.</a> Nat Commun. 12 (1), 869(2021).</li>
<li>Tao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Orai1-mediated+store-operated+Ca%282%2B%29+channel%2Fcalpain+signaling+contributes+to+high+glucose-induced+podocyte+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Enhanced Orai1-mediated store-operated Ca(2+) channel/calpain signaling contributes to high glucose-induced podocyte injury.</a> J Biol Chem. 298 (6), 101990(2022).</li>
<li>Guo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+er+ion+homeostasis+maintained+by+an+er+anion+channel+clcc1+contributes+to+als-like+pathologies%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Disruption of er ion homeostasis maintained by an er anion channel clcc1 contributes to als-like pathologies.</a> Cell Res. 33 (7), 497-515 (2023).</li>
<li>Gouin, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trpv1+and+trpa1+in+cutaneous+neurogenic+and+chronic+inflammation%3A+Pro-inflammatory+response+induced+by+their+activation+and+their+sensitization%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">Trpv1 and trpa1 in cutaneous neurogenic and chronic inflammation: Pro-inflammatory response induced by their activation and their sensitization.</a> Protein Cell. 8 (9), 644-661 (2017).</li>
<li>Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+imaging+of+cortical+neurons+using+fura-2+am%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Calcium imaging of cortical neurons using fura-2 am.</a> J Vis Exp. (23), e1067(2009).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lever-like+transduction+pathway+for+long-distance+chemical-+and+mechano-gating+of+the+mechanosensitive+piezo1+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A lever-like transduction pathway for long-distance chemical- and mechano-gating of the mechanosensitive piezo1 channel.</a> Nat Commun. 9 (1), 1300(2018).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>カメラ</td><td>ニコン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>カプサイシン</td><td>シグマ</td><td>211275</td><td></td></tr><tr><td>CL-100 温度調節器</td><td>ワーナーインスツルメンツ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>シクロピアゾン酸 (CPA)</td><td>シグマ</td><td>C1530</td><td></td></tr><tr><td>DG-4 ライト</td><td>サッター インスツルメント カンパニー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド (DMSO)&nbsp;</td><td>Amresco</td><td>231</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Thermofisher</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>蛍光イメージングソフトウェア(MetaFluor、有料ソフトウェア)&nbsp;</td><td>分子デバイス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fura-2/AM</td><td>Invitrogen</td><td>F1201</td><td></td></tr><tr><td>HBSS buffer</td><td>Gibco</td><td>14175103</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>リポフェクタミン 3000</td><td>Invitrogen</td><td>L3000008</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>&nbsp;Beyotime</td><td>ST501</td><td></td></tr><tr><td>poly-D-リジン</td><td>&nbsp;Beyotime</td><td>ST508</td><td></td></tr><tr><td>SC-20 液体循環加熱・冷却装置&nbsp;</td><td>ハーバード・イステッド・デバイス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>白色光源</td><td>ニコン</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

カルシウムイオンチャネルの活性化を研究するためのシングルセルカルシウムイメージング

Single-Cell Calcium Imaging for Studying the Activation of Calcium Ion Channels

温度応答検出 
初代ケラチノサイト 初代ケラチノサイトを新生仔マウスから単離し、確立されたプロトコル10に従って調製した。これらの細胞は、スライドガラスを含む24ウェルプレートに播種されました。Fura-2プローブを装填した後、 図2Aに示すように、顕微鏡下で380nmの波長で焦点を調整し、細胞形態を鮮明に可視化しました。プロセス中にプローブが正常にロードされなかった場合、細胞は見えません。チャンバー内の細胞外バッファーは、灌流システムを通じて連続的に交換され、細胞にとって最適な条件が確保されました。温度制御システムは灌流システムに接続され、細胞外バッファーの温度変化を制御することで細胞の熱応答を検出することができました。このプロセスでは、細胞外バッファーを徐々に加熱し、次に徐々に冷却します。
シングルセルCa2+ イメージングシステムを利用して、さまざまな実験条件下での細胞内Ca2+ 濃度の変化をモニターしました。 図2Bに示すように、ケラチノサイトは、加熱を受けると明確な熱応答を示し、冷却段階では顕著な応答を示しました。注目すべきは、この温度応答を主たる原因とするSTIM1遺伝子が欠失すると、この温度応答が消失した(図2C)10。シングルセルCa2+ イメージングは、さまざまな外部刺激に応答した細胞内Ca2+ 濃度のリアルタイムな変化を観察することが可能で、細胞の挙動やシグナル伝達の詳細な解析を可能にします。
標的プラスミドを過剰発現する細胞HEK293T HEK293T細胞をスライドガラスを含む24ウェルプレートに実験方法に従って播種した。次に、細胞をSTIM1/Orai1で過剰発現させ、その媒介熱応答を上記の初代細胞と同じ方法を用いて検出しました。標的プラスミドを過剰発現する細胞の場合、TRITCまたはFITC波長下でプラスミドが運ぶ赤色または緑色の蛍光タンパク質で示されるように、対応するプラスミドを発現する細胞を選択することにより、トランスフェクションの成功が確認されました。この実験では、STIM1-GFP/Orai1-DsRedプラスミドを使用し、FITCでGFPが検出されると緑色に蛍光を発し、TRITCでDsRedが検出されると赤色の蛍光を発しました。空のmCherry(TRITC)を過剰発現する細胞をネガティブコントロールとして使用しました。 図3Aに示すように、FITC下で観察された蛍光細胞は、STIM1の良好な発現を示し、加熱および冷却プロセス中のそれらの熱応答の選択と記録を可能にしました。トランスフェクションされなかった細胞は、ネガティブコントロールとして機能しました。 図3B は、STIM1/Orai1が冷却プロセス中に大きな熱応答を示し、 図3Cに示す負の制御とは対照的であることを示しています。
薬物反応検出 シングルセルCa2+ イメージングテクノロジーは、化合物に対する細胞応答の検出にも使用できます。熱応答検出のための細胞調製物は、上記と同じです。薬物反応と熱反応の違いは、熱反応は通常、灌流システムを介して細胞外緩衝液の温度を変えることによって細胞を活性化する必要があるのに対し、化合物は灌流によって投与するか、ピペットを使用して直接添加することによって投与できるという事実にあります。ピペットで直接添加することで、使用する化合物の量を効果的に節約できます。ただし、結果として得られる曲線は、灌流によって得られる曲線ほど視覚的に魅力的であるとは限りません。
図4を例にとると、図4AはSTIM1/Orai1の貯蔵型カルシウムエントリー(SOCE)応答を示しており、細胞外Ca2+濃度とシクロピアゾン酸(CPA)含有量が灌流システムを通じて順次変化し、SOCEを誘導します。図4Bにおいて、TRPV1アゴニストカプサイシンは、TRPV1プラスミドを過剰発現する細胞にピペットを使用して直接添加されます。カプサイシンはTRPV1を活性化し、細胞外Ca2+の流入を誘導することができます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67412/67412fig01.jpg">
図1:Fura-2 AMの概略図。Fura-2は、細胞生物学で一般的に使用されるCa2+蛍光プローブで、Ca2+に1:1の比率で選択的に結合し、蛍光を放出します。Fura-2は酸性化合物として極性が高いため、細胞内に侵入できません。細胞透過性を高めるために、負の基にアセトキシメチル(AM)を結合させてFura-2/AMを形成します。この修飾により、エステルの溶解度が向上し、負電荷が除去されます。細胞内では、Fura-2/AMはエステラーゼによって加水分解されてFura-2になり、遊離細胞質Ca2+と可逆的に結合することができます。結合すると、最大励起波長は380 nmから340 nmにシフトします(Ca2+で飽和した場合)。放出される蛍光強度は、結合したCa2+の濃度に定量的に関連しています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67412/67412fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67412/67412fig02.jpg"> 
図2:初代ケラチノサイトの温度応答検出。(A)新生仔マウスのケラチノサイトのFura-2染色を20倍対物レンズで観察。(B,C)シングルセルCa2+イメージングシステムを用いたWTケラチノサイト(B)およびSTIM1ノックアウトケラチノサイト(C)の温度応答。倍率:20倍 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67412/67412fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67412/67412fig03.jpg"> 
図3: HEK293T細胞内で過剰発現したSTIM1-GFP/Orai1-Dsredの温度応答検出。(A)FITC下でSTIM1-GFPを発現する陽性細胞を示す代表的な図。(B,C)シングルセルCa2+ イメージングシステムによって検出された、それぞれのプラスミドを発現するHEK293T細胞の温度応答。倍率:20倍 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67412/67412fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67412/67412fig04.jpg"> 
図4:シングルセルCa2+イメージングを用いた薬物反応検出。(A)STIM1/Orai1を過剰発現するHEK293T細胞のSOCE応答。細胞外バッファーは、灌流システムを使用してCa2+含有からCa2+フリーに変更されます。Ca2+がない場合、CPAを添加して小胞体からCa2+を枯渇させます。次いで、細胞外バッファーをCa2+含有バッファーに置換して、細胞外Ca2+流入を誘導する(これは、店舗操作によるCa2+エントリーを表す)。シングルセルCa2+イメージングは、これらのプロセスによって誘発される細胞質Ca2+濃度の変化を動的に記録するために利用されます。(B)TRPV1-mRubyを過剰発現する細胞HEK293T、ここでmRubyはTRPV1タンパク質のトランスフェクション状態をチェックするために使用される蛍光タンパク質です。カプサイシンはピペットを使用して追加され、Ca2+の流入はシングルセルCa2+イメージングによって記録されます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67412/67412fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

Single cell Ca2+ imaging is essential for the study of Ca2+ channels activated by various stimulations like temperature, voltage, native compound and ...

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