パッチクランプ法による新たに分離された脳底動脈平滑筋細胞における内向き整流K ⁺ 電流の記録

このプロトコルは、ラット脳底動脈から平滑筋細胞を分離し、全細胞パッチクランプ技術を使用してこれらの細胞の内部整流カリウムチャネル電流を記録するための迅速かつ効率的な方法を説明しています。これは、脳底動脈とイオンチャネルを研究する研究者に新しいアプローチを提供します。

私の研究は主に心血管電気生理学に焦点を当てています。この研究では、一次血管筋細胞を分離し、全細胞ピンチクランプ技術を利用してそれらの電気生理学的特性を支援する方法について説明します。フレッシュセルの単離には、温度が酵素分離に与える影響、血管ごとに異なる消化時間、細胞のネイティブ環境での即時能力などの制限があります。

さらに、ピンチクランプ技術は、熟練した操作を必要とする天井と膜の破裂に課題を提示します。このプロトコル施設の研究は、手動動脈から活性な初代細胞を容易に取得することにあり、すぐにピンチクランプ技術の適用を鳴らす必要があります。まず、95%の酸素と5%の二酸化炭素で飽和した冷たい生理食塩水でシャーレを満たします。

分離されたラットの脳をペトリ皿に入れます。脳をペトリ皿の腹側を上向きに置き、針で固定します。.光学顕微鏡で、脳底動脈を見つけます。

オートクレーブ、ピンセット、ハサミで、周囲の組織を慎重に取り除きます。次に、直径25マイクロメートルの長さ2センチメートルのワイヤーを孤立した脳底動脈に挿入します。動脈の内壁をワイヤーで優しくこすり、血管内皮を効果的に取り除きます。

平滑筋細胞を分離するには、まず、試験管1〜3の溶液を予熱します。孤立した脳底動脈を試験管2に移します。混合物を摂氏37度で30分間インキュベートし、95%の酸素と5%の二酸化炭素の混合物をチューブに連続的に注入します。

次に、試験管2から試験管3に脳底動脈を移し、インキュベートします。予熱した細胞分離溶液1ミリリットルを試験管1から試験管3に移します。酵素処理を3分間維持しながら、95%の酸素と5%の二酸化炭素を注入し続けます。

脳底動脈の準備をトリーツして細胞を放出します。次に、4ミリリットルの低温分離溶液を試験管3にピペットで注入し、酵素プロセスを終了します。混合物を59Gで6分間遠心分離します。

ピペットで、上清を捨てます。その後、再度冷分離液を加えます。最後の洗浄後、上清を取り除きます。

細胞懸濁液を1ミリリットル残します。細胞懸濁液を摂氏4度で6〜8時間保存します。細胞懸濁液の100マイクロリットルを浴に移します。

1ミリリットルの細胞外液を浴に加え、休ませます。まず、マイクロピペットポーラーの電源を入れます。ガラス管を極性に置きます。

コントロールパネルでプログラム1を選択します。Enterキーを押して、プログラム1にアクセスします。次に、コントロールパネルのランプをクリックしてランプテストを実行し、ガラス管の熱値を測定します。

新しいガラス管を挿入します。次に、プログラム1を選択し、Enterキーを押してマイクロピペットを製作します。ケア電流を記録するには、まずデータ収集ソフトウェアを起動します。

ファイルを選択し、データファイル名の設定をクリックして、データストレージパスを設定します。ツールメニューでメンブレンテスト機能を有効にします。ラットの脳底動脈から分離された平滑筋細胞のサンプルを顕微鏡のカメラビューの中央に置きます。

基準線の先端を浴液に浸します。次に、作製したマイクロピペットの20%に細胞内溶液を充填します。ロードされたマイクロピペットを記録電極ホルダーに固定します。

次に、シリンジで陽圧を加えます。ピペットチップを浴溶液に移動し、信号増幅器ソフトウェアでピペットオフセットを調整して、電流ベースラインをゼロピコアンペアに設定します。ピペットを細胞膜にそっと押し付けます。

少なくとも1つのマゴメに対するシール抵抗の増加を観察します。正圧を取り除き、負圧を加えます。高抵抗を確立するには、少なくとも1ギゴメのシール抵抗で、保持電圧をマイナス60ミリボルトに設定し、CP FASTおよびCP SLOWを使用して電極容量を補償します。

短時間の負圧を加えて細胞膜を破裂させ、細胞全体の構成を形成します。信号増幅器ソフトウェアでセル全体を選択します。次に、膜容量補正の[自動]をクリックします。

kirプロトコルをロードし、データ記録を開始します。紡錘体形態を有する新たに単離された平滑筋細胞を単離した。細胞は健康で、パッチクランプ実験に適していました。

典型的な硬化電流は、負の電圧で内側に整流し、正の電圧ではカリウムイオン電流の流れが最小限またはまったくありませんでした。1リットルあたり100〜300マイクロモルの濃度の塩化バリウムは、kirチャネルの活動を効果的に阻害し、電流がkirであることが確認されました。ニトロプルシドナトリウムは、SNP誘発血管拡張におけるkirチャネルの役割を示すkir電流を増加させました。

電流電圧関係の比較では、塩化バリウムの存在下では電流密度が減少し、SNPの存在下では電流密度が増加することが示されました。