iChip技術を用いた土壌微生物の分離

私たちは、農業病原体と戦うための新しいタイプの化学を発見しようとしています。iChip技術を用いて、新しい生物を分離し、新たな化学反応につながることを期待しています。これらの生物および/またはその天然物を農業病原体に対して試験することは、新しい生物農薬候補生物および/または化合物を見つけることにつながる可能性があります。

iChip法は、従来の条件下では培養できなかった微生物を、家畜化の期間を設けて自然環境と接触させることで分離することを可能にします。当社の改良型iChipは、シンプルで安価で、微生物汚染のリスクを低減し、さまざまな研究目標に容易に対応することができます。私たちのiChipの結果は、新しい微生物による病原体の抑制を促進するメカニズムは何かという疑問を提起していますか?

これらの生理活性化合物は、実際の試験で信頼性の高い性能を発揮することができますか?環境要因はその有効性にどのように影響しますか?これらの問題に取り組むことで、持続可能な生物農薬の開発、植物病害管理の変革、合成殺菌剤への依存度の低下が導かれます。

このラボでは、iChip技術を適用して、被覆作物によって生産された病気抑制土壌から新規細菌を分離し、新規微生物と生理活性化合物を特定します。これらは、農業病害を管理するための合成殺菌剤の革新的で持続可能な代替品を開発するために、制御された植物病害研究でテストされます。5 mm の寒天パンチツールを使用して改変 iChip を構築するには、96 ウェルプレートからウェルの底を取り外します。

0.05 マイクロメートルのポリカーボネートメンブレンを長方形にカットし、寸法が 96 ウェルプレートの底部と一致するようにします。シリコンシーラントを塗布して、ポリカーボネートメンブレンを96ウェルプレートの底に接着します。接着剤がウェルをシールしますが、ウェルの開口部を完全に覆っていないことを確認します。

プレートを24時間乾燥させます。AからDとラベル付けされた15ミリリットルの遠心分離管のそれぞれに、およびEからHとラベル付けされた50ミリリットルのチューブのそれぞれに4.5ミリリットルの滅菌水を追加します。次に、チューブに10ミリリットルの水を加え、混合物を10分間ボルテックスします。

土壌懸濁液が10分間沈殿するのを待ちます。次に、土壌上清0.5ミリリットルをチューブAにピペットで入れ、よく混ぜます。次に、0.5ミリリットルの細胞懸濁液をチューブAからチューブBに移し、完全に混合します。

残りのすべての遠心分離チューブについて繰り返し、8本のチューブ全体で一連の10倍希釈を完了します。まず、iChipを95%エタノールに完全に浸します。15分後、プレートをエタノールから取り出し、層流フードの滅菌ペーパータオルの上に置きます。

層流フード内の紫外線滅菌器を15分間オンにしながら、エタノールを蒸発させます。滅菌コハク酸の360マイクロリットルをピペットで、最小限の塩またはSMSメディアをプレートの最初の列に注入し、コントロールとして機能します。チューブE.Mixの細胞懸濁液に45ミリリットルのSMSを十分に加えて、細胞懸濁液と寒天を結合します。

寒天細胞混合物360マイクロリットルを96ウェルプレートの残りのすべてのウェルにピペットで移します。培地をセットしたら、プレートの上部をPCRプレートカバーで密封します。チューブF、G、Hを使用してプレートを充填し、濃度が10倍異なる合計4枚のプレートを調製します。

プレートを約1インチの土が入った容器に入れ、膜面を下に向けて置きます。蓋をした容器内のプレートを25°Cの暗闇でインキュベートします。6週間後、iChipsの微生物増殖を調べます。

改質したiChipを滅菌水で3回すすぎ、すべての土壌微粒子を取り除きます。プレートの上部と側面を95%エタノールで拭き、半透膜のある面を避けます。滅菌ブレードを使用して、コロニーを含むウェルの周りのプレートカバーを切断し、滅菌ピンセットで正方形を取り除きます。

滅菌ストリーキングツールを使用して、コロニーを突き刺し、4象限法でSMS寒天プレートにストリークします。プレートを摂氏25度で1週間、またはコロニーの成長が観察されるまでインキュベートします。インキュベーション後、コロニーを調べて培養物の分離を確認します。