Name: iChip技術を用いた土壌微生物の分離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-10T13:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 33 s
Description: 学ぶiChip技術による土壌微生物の分離法。従来の培養条件では培養できなかった新規微生物を発見し、農業病原菌に対するバイオ農薬候補の探索に応用します。持続可能な農業のための環境負荷低減に貢献します。

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<meta charset="utf8"></head><body>新規微生物培養のためのiChip法の進歩

<ol><li>Newman, D. J., Cragg, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+products+as+sources+of+new+drugs+over+the+nearly+four+decades+from+01%2F1981+to+09%2F2019%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nat+Prod%22%5BJournal%5D)">Natural products as sources of new drugs over the nearly four decades from 01/1981 to 09/2019.</a> J Nat Prod. 83 (3), 770-803 (2020).</li>
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<li>Gong, L., Wong, C. H., Idol, J., Ngan, C. Y., Wei, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-long+read+sequencing+for+whole+genomic+DNA+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Ultra-long read sequencing for whole genomic DNA analysis.</a> J Vis Exp. (145), e58954(2019).</li>
<li>Covington, B. C., Xu, F., Seyedsayamdost, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+natural+product+chemist%27s+guide+to+unlocking+silent+biosynthetic+gene+clusters%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">A natural product chemist's guide to unlocking silent biosynthetic gene clusters.</a> Annu Rev Biochem. 90, 763-788 (2021).</li>
<li>Lee, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mini+review%3A+Genome+mining+approaches+for+the+identification+of+secondary+metabolite+biosynthetic+gene+clusters+in+Streptomyces%5BTitle%5D)+AND+%22Comput+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Mini review: Genome mining approaches for the identification of secondary metabolite biosynthetic gene clusters in Streptomyces.</a> Comput Mol Biol. 18, 1548-1556 (2020).</li>
<li>Kaeverlein, T., Lewis, K., Epstein, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+%26%2334%3Buncultivable%26%2334%3B+microorganisms+in+pure+culture+in+a+simulated+natural+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Isolating &#34;uncultivable&#34; microorganisms in pure culture in a simulated natural environment.</a> Science. 296 (5570), 1127-1129 (2002).</li>
<li>Trcek, J., Mira, N. P., Jarboe, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+and+tolerance+of+bacteria+against+acetic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Adaptation and tolerance of bacteria against acetic acid.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 99 (15), 6215-6229 (2015).</li>
<li>Kurm, V., Van Der Putten, W. H., Hol, W. H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation-success+of+rare+soil+bacteria+is+not+influenced+by+incubation+time+and+growth+medium%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">Cultivation-success of rare soil bacteria is not influenced by incubation time and growth medium.</a> PLOS One. 14 (1), e0210073(2019).</li>
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<li>Lodhi, A. F., Zhang, Y., Adil, M., Deng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic+discovery%3A+Combining+isolation+chip+%28ichip%29+technology+and+co-culture+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Antibiotic discovery: Combining isolation chip (ichip) technology and co-culture technique.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 102 (17), 7333-7341 (2018).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0.1-20 &micro;L ピペットチップ</td><td>VWR</td><td>76322-158</td><td></td></tr><tr><td>0.2 mL PCR チューブ</td> 768 個入りパック <td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>AB0337</td><td>ケース 1000</td></tr><tr><td>0.5-5 mL シングルチャンネルピペット</td><td>VWR</td><td>CA11020-004</td><td></td></tr><tr><td>1 L ガラス瓶</td><td>ミリポアシグマ</td><td>CLS13951L</td><td>オートクレーブ可能である必要があります。&nbsp;</td></tr><tr><td>100 x 15 mmのペトリ板</td><td>VWR</td><td>25384-342</td><td>500</td></tr><tr><td>100%シリコーンシーラント</td><td>マリンランド</td><td>31003</td><td></td></tr><tr><td>1000 &microのケース;L マルチチャンネルピペットチップ</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>9401113</td><td>ケース 960</td></tr><tr><td>100-1000 & マイクロ;Lピペットチップ</td><td>VWR76322-164</td>パック<td>768</td><td></td></tr><tr><td>100-1000&マイクロ;Lシングルチャンネルピペット</td><td>VWR</td><td>76169-240</td><td></td></tr><tr><td>100-1200 &micro;Lマルチチャンネルピペット</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>46300800</td><td>360 &micro;Lボリューム容量。&nbsp;</td></tr><tr><td>1-10 & マイクロ;L シングルチャンネルピペット</td><td>VWR</td><td>76169-232</td><td></td></tr><tr><td>1-5 mL ピペットチップ</td><td>VWR</td><td>CA11020-008</td><td>500 15</td></tr><tr><td>mL 滅菌遠心チューブ</td><td>VWR</td><td>CA21008-918</td><td>500</td></tr><tr><td>16s rRNA-F プライマー (AGAGTTTGATCCTGGCTCAG) &ndash; 10mM</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>51-01-19-06</td><td>10 &micro;g</td></tr><tr><td>16s rRNA-R プライマー (ACGGCTACCTTGTTACGACTT) &ndash; 10mM</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>51-01-19-07</td><td>10 &micro;g</td></tr><tr><td>4 mm コルク穴あけ器</td><td>VWR</td><td>470121-860</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 滅菌遠心分離管</td><td>VWR</td><td>CA21008-940</td><td>500 ケース</td></tr><tr><td>95% エタノール</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A412-500</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>96 ウェルプレート</td><td>VWR</td><td>10062-900</td><td>ケース 100</td></tr><tr><td>オートクレーブ</td><td>コールパーマー</td><td>UZ-01850-34</td><td>8 L、115 VAC</td></tr><tr><td>細菌寒天</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>443570010</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>ビン</td><td>トーマス サイエンティフィ</td>ック <td>1216H91</td><td>5 ビン/パック</td></tr><tr><td>カサミノ酸</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>223120</td><td>500 g</td></tr><tr><td>カゼインダイジェスト</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>211610</td><td>500 g</td></tr><tr><td>電気蛍光グレード アガロー</td>ス <td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>J66501.30</td><td>250 g</td></tr><tr><td>iBright FL1500 イメージングシステム</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A44115</td><td></td></tr><tr><td>層流フード</td><td>CleanTech</td><td>1000-6-A</td><td></td></tr><tr><td>Minion ナノポアシーケンサー&nbsp;</td><td>オックスフォード ナノポアテクノロジーズ</td><td>MinIon Mk1C</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop One/One 微量 UV-Vis 分光光度計</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>ND-ONE-W</td><td></td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリーウォーター</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>AM9937</td><td>10 x 50 mL</td></tr><tr><td>ヌクレオボンド HMW DNA キット</td><td>タカラ</td><td>740160.2</td><td></td></tr><tr><td>ペーパータオル</td><td>VWR</td><td>89402-824</td><td></td></tr><tr><td>Phusion Green ホットスタート II ハイフィデリティ PCR マスターミックス</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>F566L</td><td>500 反応</td></tr><tr><td>ジャガイモデンプン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>419690025</td><td>2.5 kg</td></tr><tr><td>QIAGEN CLC Genomics Workbench ソフトウェアまたは類似の</td>もの <td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rapid Barcoding 24 キット</td><td>オックスフォード ナノポアテクノロジー</td>ズ <td>SQK-RBK114.24</td><td></td></tr><tr><td>SimpliAmp サーマルサイクラー</td><td>Applied Biosystems</td><td>A24811</td><td></td></tr><tr><td>滅菌 接種ループ 針付き</td><td>VVWR</td><td>76534-512</td><td>1000</td></tr><tr><td>ケース 滅菌外科用ブレード</td><td>VWR</td><td>76457-444</td><td></td></tr><tr><td>SYBR 安全、または類似&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>S33101</td><td></td></tr><tr><td>ウルトラピュアアガロース&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>16500-500</td><td></td></tr><tr><td>ボルテックス</td><td>VWR</td><td>76549-928</td>は<td>、15および50 mLの遠心分離管VWR</td></tr><tr><td>ステレオズーム三眼顕微鏡</td><td>VWR</td><td>89404-476</td><td></td></tr><tr><td>Whatman&nbspを収容する必要があります。核孔&nbsp;トラックエッチングメンブレンミリ</td><td>ポアシグマ</td><td>WHA113502</td><td>L x W 8&nbsp;で。×10&nbsp;で、細孔サイズ0.03&nbsp;&mu;メートル</td></tr></tbody></table>

ichip技術を用いた土壌微生物の分離

Isolation of Soil Microorganisms Using iChip Technology

プロトコルの視覚的な概要を 図1に示します。修正されたiChip実験が成功すると、少なくとも1つのプレートでウェルの25%未満で成長が含まれ、コントロールウェルでは成長が起こりません。成長を伴うこの数の井戸は、一般に、単一のコロニーが井戸で分離されることを保証します。さらに、コロニーの数、またはコロニーを含むウェルの数は、一連の希釈から調製された後続のプレートごとに10倍に減少するはずです。代表的な結果を 図 2 に示します。ここで、プレート7と8は、ウェルの25%未満で成長を含み、コロニーを含むウェルの割合は表1に示すように各プレートで減少するため、成功したiChipです 。 試験のすべてのプレートにウェルごとに複数のコロニーが含まれている場合、またはどのウェルにもコロニーがない場合、それは否定的な結果を構成します。
<img alt="微生物分離ワークフロー;シリコンコーティングプレート、遠心分離管、ピペッティング、培養。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67426/67426fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> 
図1:改良型iChipを使用して土壌微生物を培養するための概略図(A、B)プレートの構造(ステップ2)。(C)接種材料の調製(ステップ3)。(D、E) iChip セットアップ (ステップ 4)。(f)iChipのインキュベーション(ステップ5)。(G-I)分離株の従来の培地への移し替え(ステップ6)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67426/67426fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>アイチップ</td>
			<td>寒天懸濁液中の土壌濃度</td>
			<td>コロニーのある井戸</td>
			<td>コロニー形成ユニット</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E</td>
			<td>5.0 x 10-6 g/mL</td>
			<td>すべての</td>
			<td>数え切れないほどたくさんあります</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F</td>
			<td>5.0 x 10-7 g/mL</td>
			<td>すべての</td>
			<td>数え切れないほどたくさんあります</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G</td>
			<td>5.0 x 10-8 g/mL</td>
			<td>22</td>
			<td>22</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H</td>
			<td>5.0 x 10-9 g/mL</td>
			<td>6</td>
			<td>6</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1:成功したiChip実験の代表的なデータで、コロニーを含むウェルの数は、連続して希釈するごとに減少します。
<img alt="マイクロプレートアッセイ図;マルチウェルプレートを用いた生化学分析のための実験レイアウト" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67426/67426fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> 
図2:2つの成功した改変iChipの例示的な結果。 iChipは、(A)細胞寒天混合物Gから調製したプレートには22コロニーが含まれ、(B)細胞寒天混合物Hから調製したプレートには6つのコロニーが含まれ、混合物間の10倍の希釈差と一致するという同じ実験から得られたものです。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67426/67426fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
図3A-Gに示すように、コロニーを肉眼または顕微鏡で視覚化できます。コロニーは、図3Bに見られるように寒天の表面に成長しているかもしれないし、図3Fのコロニーのように寒天に埋め込まれているかもしれない。図3Gのように、成功した改変iChipの同じウェルに2つのコロニーがある場合があります。場合によっては、コロニーが十分に離れているため、別々に針で穴を開けて継代培養することができます。しかし、図3Gのものは、無菌性微生物として容易に培養できるとは考えにくい。iChipから従来のSMSメディアに転送されたコロニーの例を図4に示します。
<img alt="培養中の細菌増殖を分析するペトリ皿実験。コロニーを強調する顕微鏡画像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67426/67426fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> 
図3:インキュベーション6週間後にiChipで成長するコロニーの代表的な顕微鏡図(A-F)継代培養されるべき単一のコロニーが観察され、(G)2つのコロニーが近接して観察され、これらは無菌培養としては得られにくい。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67426/67426fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="寒天プレート上での細菌コロニー増殖,微生物実験,シャーレ分析" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67426/67426fig04.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> 
図4:改変されたiChipから分離された細菌の代表的な結果。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67426/67426fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a>
改変されたiChipから従来の寒天プレート上にコロニーを分離する能力も、実験の成功を決定します。改変されたiChipで増殖するすべてのコロニーが、従来のプレートへの転写後も生き残るわけではありません。iChipでは、コロニーは成長因子と土壌栄養素にさらされ、栽培性が向上します。一部の微生物にとって、家畜化の期間では、従来の条件で培養可能にするには不十分です。iChipからプレートへのコロニーの回収率は実験ごとに異なりますが、この方法では容易に培養可能な微生物も培養できるため、プレートで成長するものもあります。例えば、 図2 の改変iChipには合計28個のコロニーが含まれており、継代後に寒天プレート上で成長したコロニーの数は16個でしたが、12個は移植後も生き残れませんでした。分離物は、 図4に示すように、フルサイズの寒天プレートで培養すると、同定してさらなる研究に使用できます。
改変iChip実験が成功すると、既知の微生物と種レベルで異なる微生物が分離されるはずです。各分離株と既知の微生物との類似性の程度は、単離されたDNAを既知の微生物のゲノムと比較することによって見つけられます。各分離株に最も近い関連微生物のテトラ Z スコアは、類似性の割合を表します。 図5 は、単離された12の細菌のうち、4つは新種以上、2つはおそらく新株、6つは既知の微生物であることを示しています。いくつかの新規種または株の回収は、以前に発表されたiChip実験と一致しており、この改変されたiChip構造が新規種11の回収の増加を妨げないことを示している。
<img alt="分類学的新規性分析円グラフ。ichip分離株からの6つの既知の種、2つの可能性のある4つの新種。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67426/67426fig05.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> 
図5:iChip実験から回収された分離株の分類学的分類レベル。 類似性の割合は、既知の細菌に対する分離株の類似性を説明するテトラZスコアに基づいて決定されました。このスコアは、&gt;99.9%の類似性が種の一致を示し、98.9%-99.9%の類似性が新種の可能性があることを示し、&lt;98.9%の類似性が新種以上を示します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67426/67426fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

iChip技術を用いた土壌微生物の分離

The iChip isolation technique uses an in-situ isolation device that increases the cultivability of previously unculturable microorganisms. Microorganisms ...

isolation-of-soil-microorganisms-using-ichip-technology

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

等速電気泳動（ITP）は、毒素の検出からサンプル調製に至るまでのアプリケーションで堅牢な電分離と濃縮技術です。小分子および細胞培養溶解液からの核酸の精製の分離と検出：我々はITPと2具体例のアプリケーションにこのテクニックを適用する方法論の物理的原理を確認します。...

イオンの分離及び核酸の精製のためのオンチップ等速電気泳動

"生分解性"というラベルの付いたプラスチックフィルムはmulchesとして農業用市販されている。耕作は、魅力的な処分方法を表しますが、フィールド条件下での劣化はあまり理解されています。本研究の目的は、フィールド埋葬後にプラスチックマルチフィルムを植民ネイティブ土壌菌類や細菌を単離する方法を開発することであった。...

農業で使用する生分解性プラスチックマルチフィルムを分解するための可能性を持つネイティブ土壌微生物の分離

細菌は、その微生物の隣人の生理機能に影響を及ぼす可能性があり、分泌された化合物を製造する。ここでは、固体培地上で枯草菌の蛍光転写レポーター株と土壌微生物を混合することにより、このような化学的に仲介される種間の相互作用の検出を可能にする共培養画面について説明します。...

化学的に媒介種間相互作用を検出するための共培養を使用して

昆虫病原性真菌コロニーは、 テネブリオ 餌、 ガレリア...

土壌試料からの昆虫病原性菌類の分離方法の比較

このプロトコルは、わずか7日間で大量の土壌サンプルから酵母とカビ アスペルギルス フミガーツス を培養する効果的で迅速な方法です。この方法は、実験に必要なさまざまなインキュベーション培地と温度に対応するように簡単に変更できます。...

土壌からの培養酵母・カビの分離による菌群構造調査

ここでは、土壌生物多様性をスクリーニングして、不本意な物質の分解に関与する真菌株を探すためのプロトコルを提示する。まず、フミン酸またはリグノセルロース上で増殖することができる真菌株が単離される。その後、それらの活性は酵素アッセイと炭化水素やプラスチックなどの汚染物質の両方でテストされます。...

難治性物質の分解に関与する菌類の土壌生物多様性からの単離とスクリーニング

このプロトコルは、自然環境における難治性土壌微生物の in situ 培養のための分離チップ(iChip)の設計と使用について説明しています。また、抗菌剤を産生する土壌細菌の その場 培養についても説明しています。このプロトコルは、他の望ましい特性を持つ多様なニッチから細菌を回収するように適応させることができます。...

その場で分離チップを用いた難治性土壌細菌の分離と培養 (iChip)

この原稿は、特定のオリゴヌクレオチド指向濃縮を介して真核細胞で形成された選択された同族RNPを単離するアプローチを説明しています。DHX9/RNAヘリカーゼAで構成されるレトロウイルス5'非翻訳領域に結合した同族RNPを単離することにより、このアプローチの適用性を実証します。...

オリゴヌクレオチド指向溶出を用いて細胞から同族RNA-タンパク質複合体の単離

ミトコンドリアは、植物細胞のわずかな割合は、彼ら研究の範囲を精製する必要があります。ミトコンドリアは、均質化、続いて高純度ミトコンドリア分画を取得する微分と密度勾配遠心法によってさまざまな植物器官から分離できます。...

分離とシロイヌナズナ由来のミトコンドリアの呼吸測定

ここでは、3色 smFRET データと 3 D アンサンブル隠されたマルコフ...

3色 1 分子 FRET を使用して蛋白質の相互作用の相関関係を研究するには

学ぶiChip技術による土壌微生物の分離法。従来の培養条件では培養できなかった新規微生物を発見し、農業病原菌に対するバイオ農薬候補の探索に応用します。持続可能な農業のための環境負荷低減に貢献します。

iChip技術を用いた土壌微生物の分離

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