2024年11月1日
蛍光トマトレクチンの眼窩後注射後、血小板由来成長因子受容体βによる免疫蛍光染色により、網膜血管系の周皮細胞を調べました。標識された網膜をさらに組織透明化法で処理し、共焦点顕微鏡下で網膜血管系を取り巻く周皮細胞の3次元ビューを視覚化するために全体をマウントしました。
この研究の範囲は、高度なイメージング技術を使用して、網膜血管系内の寄生虫の形態と空間分布を研究することです。寄生虫の形態学的特徴を実証するための詳細なビューを提供するために、本研究では、蛍光剤の眼窩後注射、免疫蛍光染色、および組織透明化処理を組み合わせた新しいアプローチを説明し、私たちの分野の研究を前進させました。
マウス網膜組織の事前透明化状態と比較して、蛍光トマトラクチンとPDGFR-ベータで標識された血管および寄生虫のバックグラウンドシグナルは、組織透明化後に大幅に減少し、それらの空間的関係のより正確な観察を容易にします。
私たちの結果は、これらの技術が網膜マウント全体の網膜血管系の寄生虫を実証するのに非常に適合することを示しています。これらの組織学的手法を組み合わせることで、寄生虫の形態学的特徴を3次元から詳細に可視化することができます。
[講師]まず、麻酔をかけたマウスを頭を左に向けて右側臥位に置きます。眼窩周囲領域を2本の指でそっと押して、マウスの左目を露出させます。27ゲージの針を備えた1ミリリットルの注射器を使用して、眼窩静脈洞に約2〜3ミリメートルをそっと突き刺し、針の斜角が45度の角度で前を向くようにします。0.1ミリリットルの蛍光トマトラクチンを眼窩静脈洞に注入します。眼窩後注射を5分間行った後、マウスを安楽死させ、手術用ハサミを使用して胸腔を開きます。24ゲージの針を左心室頂点から左心室に2ミリメートル挿入します。20ミリリットルの0.9%生理食塩水で毎分3ミリリットルの速度で灌流を実行し、続いて20ミリリットルの4%生理食塩水を投与します。0.1ミリリットルの0.9%ホルムアルデヒドを0.1モルリン酸緩衝液に注入します。次に、犠牲にしたネズミを横向きに置き、はさみで目を覆っている皮膚を取り除きます。はさみと鉗子で目を摘出します。視神経と周囲の組織を切断し、目を持ち上げます。眼を12ウェルプレートに移し、0.1モルリン酸緩衝液中の4%ホルムアルデヒドに2時間固定します。固定後、溶液の底に沈むまで、摂氏4度の0.1モルリン酸緩衝液中の25%スクロースで眼を凍結保護します。プラスチック製のパストールピペットを使用して、0.1モルのリン酸緩衝液を含むペトリ皿に目を移します。角膜の縁を鋭利なハサミで突き刺し、角膜と虹彩の周りを切り、捨てます。鉗子を使用して、レンズと硝子体液を取り除きます。次に、細い鉗子を使用して、カップ型の網膜を目の中心から引き離します。きれいなペトリ皿で0.1モルのリン酸緩衝液で網膜をすすぎます。カップ型マウス網膜を単離した後、0.1モルリン酸緩衝液中の2%Triton X-100溶液とともに20時間インキュベーターで摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日、網膜をブロッキング溶液に移し、摂氏4度で一晩シェーカー上で72 RPMで回転させます。次に、希釈バッファー中のヤギ抗PDGFRベータの一次抗体を含む微量遠心チューブに網膜を入れます。シェーカーのチューブを摂氏4度で2日間回転させます。2日後、室温で洗浄バッファーで網膜を2回洗浄します。網膜を洗浄バッファーに入れ、摂氏4度で一晩シェーカーに移します。翌日、ロバ抗ヤギ488の二次抗体1ミリリットルあたり1ミリグラムと蛍光核染色DAPIの1ミリリットルあたり0.2ナノグラムの溶液を含む微量遠心チューブに網膜を移します。シェーカーのチューブを摂氏4度で5時間72RPMで回転させます。網膜を洗浄バッファーを含む6ウェルプレートで室温で2回1時間洗浄します。網膜をシェーカー上の洗浄バッファーで摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日、網膜を組織透明化試薬に移し、シェーカー上で摂氏37度で60RPMで1時間静かに回転させます。組織の透明化後、きれいなペトリ皿で0.1モルのリン酸緩衝液で網膜をすすぎます。バネハサミを使って、網膜の半径の約2/3に達する放射状の切開を4つ行い、花びらの形を作ります。網膜を平らにし、網膜の内側を上に向けて顕微鏡スライドに取り付けます。小さな吸収紙を使用して、余分なリン酸緩衝液を取り除きます。取り付けられた網膜をスペーサーで囲みます。新鮮な組織透明化試薬で隙間を埋め、その上にカバースリップを置きます。パノラマ組織スライススキャナーを使用して、標識された網膜のモンタージュビューをスキャンします。開口数がそれぞれ0.40と0.95の2倍と10倍のレンズを搭載したイメージングシステムを使用して、高倍率の画像を撮影します。 標識された網膜から2マイクロメートルのフレームで50Zスタック画像をキャプチャします。[開始焦点面の設定]、[終了焦点面の設定]、[ステップサイズの設定]を順次クリックし、[深度パターン]、[画像キャプチャ]、および [Z シリーズ] を選択して、投影モードとトポグラフィーモードを使用して、すべての画像を 1 つの焦点付き画像に統合します。次に、499ナノメートルと519ナノメートルの緑色蛍光、591ナノメートルと618ナノメートルの赤色蛍光、401ナノメートルと421ナノメートルの青色蛍光を使用して画像をキャプチャします。[新しいサーフェスの追加]、[ボリューム設定]、[ソース チャネルの調整]、[表示の調整]、[サーフェス角度の調整]、および [スナップショット] を順次選択して、Z-Stack 共焦点画像を解析ソフトウェアにインポートし、3 次元パターンで画像を再構築します。マウント網膜全体の組織の透明性は、組織クリアリングのない網膜と比較して、組織クリアリング処理後に増加しました。トマトレクチンで標識された網膜血管系とPDGFR-βで標識された網膜寄生虫は、組織のクリアリングの前後の両方で見られましたが、組織のクリアリング後にバックグラウンドノイズが減少しました。網膜寄生虫は維管束樹に沿って観察され、網膜の中心部から周辺領域への段階的な分布を示しました。透明な網膜からの3次元Zスタック画像は、毛細血管内のPDGFR-β染色がより強い、さまざまな直径の網膜血管に寄生虫がしっかりと包まれていることを示しました。
この研究は、先進的なイメージング技術を用いて網膜血管における細網細胞の形態と空間分布を調査します。蛍光剤の網膜後注入、免疫蛍光染色、組織クリアリング法を組み合わせることで、血管を囲む細網細胞の可視化を向上させることを目指しています。
Three-dimensional visualization of retinal pericytes using immunostaining and tissue clearing enables precise morphological and spatial analysis critical for early-stage vascular target validation. This approach enhances predictive confidence in disease-relevant models by reducing background noise and improving the clarity of pericyte-vasculature interactions. Such high-resolution imaging supports risk-adjusted decisions in ophthalmic and vascular drug discovery portfolios.
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling high-resolution, quantitative imaging of pericytes in whole-mount retina.