Name: 免疫染色によるマウス網膜血管周皮細胞の3D可視化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: 学ぶマウス網膜血管周皮細胞の3D可視化法。蛍光トマトレクチンとPDGFR-β免疫染色、組織透明化を組み合わせ、共焦点顕微鏡で周皮細胞の形態と空間分布を詳細に観察する手法です。

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<meta charset="utf8"></head><body>組織透明化と蛍光標識を用いた網膜周皮細胞の可視化

<ol><li>Dreisig, K., Blixt, F. W., Warfvinge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+cryo-sections%2C+whole-mounts%2C+and+hypotonic+isolated+vasculature+preparations+for+immunohistochemical+visualization+of+microvascular+pericytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Retinal cryo-sections, whole-mounts, and hypotonic isolated vasculature preparations for immunohistochemical visualization of microvascular pericytes.</a> J Vis Exp. (140), e57733(2018).</li>
<li>Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+mount+immunofluorescent+staining+of+the+neonatal+mouse+retina+to+investigate+angiogenesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole mount immunofluorescent staining of the neonatal mouse retina to investigate angiogenesis in vivo.</a> J Vis Exp. (77), e50546(2013).</li>
<li>Park, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plastic+roles+of+pericytes+in+the+blood-retinal+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Plastic roles of pericytes in the blood-retinal barrier.</a> Nat Commun. 8, 15296(2017).</li>
<li>Hughes, S., Chan-Ling, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+smooth+muscle+cell+and+pericyte+differentiation+in+the+rat+retina+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Characterization of smooth muscle cell and pericyte differentiation in the rat retina in vivo.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (8), 2795-2806 (2004).</li>
<li>Puro, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinovascular+physiology+and+pathophysiology%3A+New+experimental+approach%2Fnew+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Retinovascular physiology and pathophysiology: New experimental approach/new insights.</a> Prog Retin Eye Res. 31 (3), 258-270 (2012).</li>
<li>Hutter-Schmid, B., Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-derived+growth+factor+receptor-beta+is+differentially+regulated+in+primary+mouse+pericytes+and+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Neurovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Platelet-derived growth factor receptor-beta is differentially regulated in primary mouse pericytes and brain slices.</a> Curr Neurovasc Res. 13 (2), 127-134 (2016).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demonstrating+hairy+and+glabrous+skin+innervation+in+a+3d+pattern+using+multiple+fluorescent+staining+and+tissue+clearing+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Demonstrating hairy and glabrous skin innervation in a 3d pattern using multiple fluorescent staining and tissue clearing approaches.</a> J Vis Exp. (183), e63807(2022).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+the+calcitonin+gene-related+peptide+immunoreactive+innervation+of+the+rat+cranial+dura+mater+with+immunofluorescence+and+neural+tracing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualizing the calcitonin gene-related peptide immunoreactive innervation of the rat cranial dura mater with immunofluorescence and neural tracing.</a> J Vis Exp. (167), e61742(2021).</li>
<li>Batista, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normative+mice+retinal+thickness%3A+16-month+longitudinal+characterization+of+wild-type+mice+and+changes+in+a+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Aging+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Normative mice retinal thickness: 16-month longitudinal characterization of wild-type mice and changes in a model of Alzheimer's disease.</a> Front Aging Neurosci. 15, 1161847(2023).</li>
<li>Huang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericyte-endothelial+interactions+in+the+retinal+microvasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Pericyte-endothelial interactions in the retinal microvasculature.</a> Int J Mol Sci. 21 (19), 7413(2020).</li>
<li>Dong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome-mediated+delivery+of+an+anti-angiogenic+peptide+inhibits+pathological+retinal+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Exosome-mediated delivery of an anti-angiogenic peptide inhibits pathological retinal angiogenesis.</a> Theranostics. 11 (11), 5107-5126 (2021).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retro-orbital+injection+of+fitc-dextran+is+an+effective+and+economical+method+for+observing+mouse+retinal+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Retro-orbital injection of fitc-dextran is an effective and economical method for observing mouse retinal vessels.</a> Mol Vis. 17, 3566-3573 (2011).</li>
<li>Riew, T. R., Jin, X., Kim, S., Kim, H. L., Lee, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+dynamics+of+cells+expressing+ng2+and+platelet-derived+growth+factor+receptor-%CE%B2+in+the+fibrotic+scar+formation+after+3-nitropropionic+acid-induced+acute+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Temporal dynamics of cells expressing ng2 and platelet-derived growth factor receptor-β in the fibrotic scar formation after 3-nitropropionic acid-induced acute brain injury.</a> Cell Tissue Res. 385 (3), 539-555 (2021).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+cubic+protocols+for+whole-brain+and+whole-body+clearing+and+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Advanced cubic protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging.</a> Nat Protoc. 10 (11), 1709-1727 (2015).</li>
<li>Liang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cubic+protocol+visualizes+protein+expression+at+single+cell+resolution+in+whole+mount+skin+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Cubic protocol visualizes protein expression at single cell resolution in whole mount skin preparations.</a> J Vis Exp. (114), e54401(2016).</li>
<li>Burns, S. A., Elsner, A. E., Gast, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+retinal+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Imaging the retinal vasculature.</a> Annu Rev Vis Sci. 7, 129-153 (2021).</li>
<li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+clarity+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Advanced clarity for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).</li>
<li>Cai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Panoptic+imaging+of+transparent+mice+reveals+whole-body+neuronal+projections+and+skull-meninges+connections%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections.</a> Nat Neurosci. 22 (2), 317-327 (2019).</li>
<li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clarifying+tissue+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Clarifying tissue clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li>
<li>Alarcon-Martinez, L., Yemisci, M., Dalkara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericyte+morphology+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Histol+Histopathol%22%5BJournal%5D)">Pericyte morphology and function.</a> Histol Histopathol. 36 (6), 633-643 (2021).</li>
<li>Dessalles, C. A., Babataheri, A., Barakat, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericyte+mechanics+and+mechanobiology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Pericyte mechanics and mechanobiology.</a> J Cell Sci. 134 (6), jcs240226(2021).</li>
<li>Alarcon-Martinez, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurovascular+dysfunction+in+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Neurovascular dysfunction in glaucoma.</a> Prog Retin Eye Res. 97, 101217(2023).</li>
<li>Uemura, M. T., Maki, T., Ihara, M., Lee, V. M. Y., Trojanowski, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+microvascular+pericytes+in+vascular+cognitive+impairment+and+dementia%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Aging+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Brain microvascular pericytes in vascular cognitive impairment and dementia.</a> Front Aging Neurosci. 12, 80(2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール (DAPI)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>D3571</td><td>光から保護</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 ロバ抗ヤギ IgG (H+L)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>A-11055</td><td>光から保護</td></tr><tr><td>C57BL/6 マウス 北京</td><td>バイタルリバー実験動物技術有限公司</td><td>SCXK (Jing) 2021-0006</td><td></td></tr><tr><td>共焦点イメージング システム</td><td>オリンパス</td><td>FV1200</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗 PDGFR-&</td><td>研究開発</td><td>AF1042</td><td>25&micro;g&nbsp;</td></tr><tr><td>Imaris ソフトウェア</td><td>Oxford Instruments</td><td>v.9.0.1</td><td></td></tr><tr><td>Lycopersicon esculentum(トマト) レクチン、DyLight594</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L32471</td><td>1 mg</td></tr><tr><td>微量遠心チューブ</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td>1.5 mL</td></tr><tr><td>正常ロバ血清</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>パノラマ組織スライススキャナー</td><td>オリンパス</td><td>VS120-S6-W</td><td></td></tr><tr><td>Photoshop および&nbsp;イラスト</td><td>Adobe</td><td>CS6</td><td></td></tr><tr><td>RapiClear 1.52 ソリューション</td><td>SunJin Lab</td><td>RC152001</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>6 ウェル プレート</td><td>Costar</td><td>3335</td><td></td></tr><tr><td>スプリング ハサミ&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>15003-08</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus 顕微鏡スライド</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4951PLUS-001</td><td>25 mm x 75 mm x 1 mm</td></tr></tbody></table>

免疫染色によるマウス網膜血管周皮細胞の3d可視化 

3D Visualization of Retinal Vascular Pericytes in Mice by Immunostaining

ホールマウント網膜の外観から見ると、組織クリア処理を施した膝膜と比較して、組織クリア処理を施した膝膜の組織透明度は、ホールマウント網膜の組織透明度が向上しました(図1)。
ホールマウント網膜の組織学的検査では、眼窩後注射により、網膜血管系を蛍光トマトレクチンで赤色で標識し、網膜周皮細胞をPDGFR-βで緑色で示しました(図2、 図3、 および図4)。この標識は、組織クリアリングの前後でサンプルで観察できましたが、比較として、組織クリア処理により網膜サンプルのバックグラウンドノイズが減少しました(図2)。また、この処理により、パノラマ組織スライススキャナー(図2)およびレーザー走査型共焦点顕微鏡(図3)により、標識された網膜周皮細胞および血管系がより鮮明になりました。
網膜周皮細胞のグラデーション分布は、網膜血管樹に沿ってここでも示されています(図3)。網膜の中央部から末梢部にかけて、網膜血管系の基底膜には、血管幹や枝、毛細血管などが中心となっております(図3)。
以上の観察結果に基づき、透明化された網膜試料からの高倍率Zスタック画像を用いて、周皮細胞と網膜血管系の空間的相関をさらに評価しました(図4)。画像処理システムの助けを借りて、さらに3Dビューを提供して、周皮細胞が異なる直径で網膜血管系にしっかりと巻き付けられていることを示しました(図4)。 図4A0-D0 は、網膜血管の上位から下位への階層的な分岐を表しています。周皮細胞は毛細血管に豊富に分布しているため、 図4D0 のPDGFRβ染色は、 図4A0-C0と比較して強い強度とシグナルを示しています。
組織除去処理を伴わないマウス網膜(図1A、 図2A、 図3A0-D0)とは対照的に、本アプローチは、ホールマウント網膜からの周皮細胞と血管との間の空間的関係を実証するための網膜背景信号を効果的に減少させた(図1B、 図2B、 図3A1-D1)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67436/67436fig01.jpg"> 
図1:組織透明化処理なしと組織透明化処理ありのマウント網膜全体の光学的透過性の比較。 (A、B)組織透明化処理前と(B)後のマウント網膜全体の外観。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67436/67436fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67436/67436fig02.jpg"> 
図2:組織透明化処理の有無と使用時における全マウント網膜からの網膜周皮細胞および血管系の標識特徴の比較。 (A、B)組織透明化処理前と(B)組織透明化処理後の全マウント網膜の代表的なモンタージュビューをVirtual Slide Systemで撮影した。血管系は赤(蛍光トマトレクチン)、周皮細胞は緑(PDGFR-β)、細胞核は青(DAPI)です。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67436/67436fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67436/67436fig03.jpg"> 
図3:組織クリア処理前と組織クリア処理後における網膜血管樹に沿った網膜周皮細胞のグラデーション状の画像解像度の比較 (A-D) 組織クリア処理前(A0-D0)と組織クリア処理後(A1-D1)の標識網膜の代表画像は、血管幹(A0、A0、 A1)、1 次分岐 (B0、B1)、2 次分岐 (C0、C1)、およびキャピラリー (D0、D1)。血管系は赤(蛍光トマトレクチン)、周皮細胞は緑(PDGFR-β)、細胞核は青(DAPI)です。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67436/67436fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67436/67436fig04.jpg"> 
図4:周皮細胞と異なる直径の網膜血管系との空間的相関。 (A-D)網膜血管樹に沿った標識網膜からの代表的な高解像度画像で、血管幹(A0、A1)、1次枝(B0、B1)、2次枝(C0、C1)、毛細血管(D0、D1)など、さまざまな直径の網膜血管系を取り巻く周皮細胞の分布を示しています。A1-D1:パネルA0-D0の対応する画像を再構成して、3次元ビューで異なる直径の網膜血管系と周皮細胞の空間的相関を示し、さらにパネルA1-D1(矢印)の局所領域の拡大ビューをインセットで示しました。血管系は赤(蛍光トマトレクチン)、周皮細胞は緑(PDGFR-β)、細胞核は青(DAPI)です。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67436/67436fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

免疫染色によるマウス網膜血管周皮細胞の3D可視化 

Retinal pericytes are essential for vascular development and stability of the retina, playing a key role in maintaining the integrity of the retinal ...

3d-visualization-retinal-vascular-pericytes-mice

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

出典:Wang, Z., et al. Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina. J. Vis. Exp. (2021).このビデオでは、2光子顕微鏡を用いたin vivo網膜イメージングの技術を紹介しています。麻酔マウスは、頭部を固定し、眼の潤滑剤を塗布し、眼にカバースリップを貼ることでイメージングの準備をします。蛍光タンパク質を発現する網膜神経節細胞(RGC)は、まず落射蛍光を用いてアラインメントして可視化します。最後に、2光子イメージングが採用されており、RGCの高解像度の視覚化が可能です。...

マウス網膜のTwo-Photon In Vivoイメージング

新生児マウスの網膜は血管新生を調節する別の遺伝子や薬剤の役割の調査を可能にし、血管新生のよく特徴付け生理学的モデルを提供...

血管新生を調査するために新生児マウス網膜の全体のマウント免疫蛍光染色<em生体内で&gt;</em

生体内顕微鏡検査は、動物で網膜血管の直径、血流速度、および総網膜血流を視覚化および測定するために使用できます。...

マウスの網膜血流の生体内ビデオ顕微鏡測定

げっ歯類の網膜は、長い脳へのアクセス可能なウィンドウとして認識されている。この技術的な論文では、虚血性損傷後の中枢神経系内の血管再生の故障につながるメカニズムを研究するために、酸素誘発性網膜症のマウスモデルを採用しているプロトコルを提供する。説明したシステムはまた、網膜およびCNS内の機能の血管の成長を促進するための戦略を探求するために利用することができる。...

マウス網膜を使用してCNSにおける血管再生の評価

ラット網膜血管ペリサイト、すなわち、低温セクション、全体-マウント、および血管ネットワークの低張性分離の免疫組織化学的可視化のための 3...

網膜の低温電子顕微鏡セクション全体-マウント、および微小血管の免疫組織化学的可視化の低張性分離血管準備

in vivoイメージングは、健康と疾患における生物学の研究のための強力なツールです。このプロトコルは、標準的な2光子顕微鏡によるマウス網膜の経瞳孔イメージングについて説明しています。また、網膜の複数の細胞コホートを蛍光標識するためのさまざまなin...

経瞳孔二光子マウス網膜のin vivoイメージング

このプロトコルは、マウス網膜フラットマウントの調製および免疫蛍光染色および分析のための詳細な方法を記載する。マウスの仔に対するフルオレセイン眼底造影(FFA)の使用および画像処理についても詳細に説明されている。...

酸素誘発網膜症マウスモデルにおける網膜血管の動的成長のモニタリング

この記事では、実装網膜製剤全体に対する確立された再現性のあるレクチン染色アッセイと、増殖性および不拡散性網膜症において頻繁に変化する血管パラメータの定量的測定に必要なプロトコルについて説明する。...

不拡散性網膜症を有するマウスの全型網膜における血管パラメータの定量化

マウス網膜血管系は、血管パターン形成のメカニズムを理解する上で特に興味深いものです。このプロトコルは、視神経乳頭から一定の距離にある蛍光血管造影眼底画像からマウス網膜血管の直径を自動的に測定します。...

マウス蛍光血管造影画像からの網膜血管径の測定

酸化ストレスやサイトカインなどの糖尿病/糖尿病性網膜症関連の侮辱による死に対する網膜血管系の回復力を監視するために、保護アッセイが開発されました。...

マウスの糖尿病関連死からの網膜血管系の保護を検出するためのアッセイ

この原稿では、マウスの眼から網膜グリアMüller細胞を単離するための詳細なプロトコルについて説明しています。プロトコールは、マウスの眼の除核と解剖から始まり、続いてMüller細胞の単離、播種、および培養が行われます。...

初代マウス網膜グリアミュラー細胞の単離

学ぶマウス網膜血管周皮細胞の3D可視化法。蛍光トマトレクチンとPDGFR-β免疫染色、組織透明化を組み合わせ、共焦点顕微鏡で周皮細胞の形態と空間分布を詳細に観察する手法です。

免疫染色によるマウス網膜血管周皮細胞の3D可視化

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